Дидезоксинуклеотид - Википедия - Dideoxynucleotide

Молекулярная структура 2 ', 3'-дидезоксиаденозинтрифосфата (ddATP)

Дидезоксинуклеотиды являются ингибиторами удлинения цепи ДНК-полимераза, используемый в Метод Сенгера для секвенирования ДНК.[1] Они также известны как 2 ', 3', потому что позиции 2 'и 3' на рибоза не имеют гидроксильных групп и сокращенно обозначаются как ddNTPs (ddGTP, ddATP, ddTTP и ddCTP).[2]

Роль в методе Сэнгера

Ингибирование нуклеофильной атаки из-за отсутствия 3'-ОН группы

Метод Сэнгера используется для амплификации целевого сегмента ДНК, чтобы можно было точно определить последовательность ДНК. Включение ddNTP в реакционные клапаны просто используется для прекращения синтеза растущей цепи ДНК, что приводит к частично реплицированным фрагментам ДНК. Это потому что ДНК-полимераза требуется 3 'OH-группа растущей цепи и 5' фосфатная группа входящего dNTP для создания фосфодиэфирная связь.[2] Иногда ДНК-полимераза будет включать ddNTP, и отсутствие 3'-ОН группы будет прерывать реакция конденсации между 5 'фосфатом (после расщепления пирофосфат ) входящего нуклеотида с 3'-гидроксильной группой предыдущего нуклеотида на растущей цепи. Эта реакция конденсации обычно происходит с включением немодифицированного dNTP ДНК-полимеразой. Проще говоря, нуклеофильная атака 3 'OH-группы приводит к добавлению нуклеотида в растущую цепь. Отсутствие 3'-гидроксильной группы препятствует этой нуклеофильной атаке, блокируя способность ДНК-полимераз продолжать свою функцию. [2]

Это открытие привело к его подходящему названию «Нуклеотиды, обрывающие цепь».[2] Дидезоксирибонуклеотиды не имеют 3'-гидроксильной группы, поэтому дальнейшее удлинение цепи не может происходить, если этот дидезоксинуклеотид находится в цепи. Это может привести к обрыву последовательности ДНК. Таким образом, эти молекулы составляют основу метод обрыва цепи дидезокси из Секвенирование ДНК, о чем сообщил Фредерик Сэнгер и его команда в 1977 г.[3] как продолжение более ранней работы.[4] Подход Сэнгера был описан в 2001 году как один из двух фундаментальных методов секвенирования фрагментов ДНК.[1] (другой Метод Максама – Гилберта[5]), но метод Сэнгера является одновременно «наиболее широко используемым и методом, используемым большинством автоматических секвенаторов ДНК».[1] Сэнгер выиграл свой второй Нобелевская премия по химии в 1980 году, поделившись им с Уолтер Гилберт («За их вклад в определение последовательностей оснований в нуклеиновых кислотах») и с Пол Берг ("За фундаментальные исследования биохимии нуклеиновых кислот, особенно рекомбинантная ДНК "),[6] и обсудил использование дидезоксинуклеотидов в своей Нобелевской лекции.[7]

Секвенирование ДНК

Дидезоксинуклеотиды полезны при секвенировании ДНК в сочетании с электрофорез. Образец ДНК, прошедший ПЦР (полимеразной цепной реакции ) в смеси, содержащей все четыре дезоксинуклеотиды и один дидезоксинуклеотид будет давать нити длиной, равной положению каждого основания того типа, который дополняет тип, имеющий присутствующий дидезоксинуклеотид. В полимераза taq Используемый в ПЦР благоприятствует ddGNTP, что является закономерностью, наблюдаемой в различных исследованиях.[8] То есть каждое нуклеотидное основание этого конкретного типа имеет вероятность быть связанным не с дезоксинуклеотидом, а скорее с дидезоксинуклеотидом, что завершает удлинение цепи. Следовательно, если образец затем подвергается электрофорезу, будет присутствовать полоса для каждой длины, на которой дополнять дидезоксинуклеотида. В настоящее время принято использовать флуоресцентные дидезоксинуклеотиды, так что каждый из четырех имеет различную флуоресценцию, которую можно обнаружить с помощью секвенатора; таким образом, нужна только одна реакция.

Рекомендации

  1. ^ а б c Мейс Р.Дж., Рагхавачари Р. (2001). «Применение ближнего инфракрасного диапазона в секвенировании и анализе ДНК». В Raghavachari R (ред.). Приложения ближнего инфракрасного диапазона в биотехнологии. CRC Press. С. 133–150. ISBN  9781420030242.
  2. ^ а б c d Уотсон Дж. Д., Бейкер Т. А., Белл С. П., Ганн А., Левин М., Лосик Р. (2014). Молекулярная биология гена (7-е изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Пирсон. С. 160–161. ISBN  978-0-321-76243-6.
  3. ^ Сэнгер Ф, Никлен С., Колсон А. Р. (декабрь 1977 г.). «Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 74 (12): 5463–7. Bibcode:1977ПНАС ... 74.5463С. Дои:10.1073 / pnas.74.12.5463. ЧВК  431765. PMID  271968.
  4. ^ Сэнгер Ф, Coulson AR (май 1975 г.). «Экспресс-метод определения последовательностей в ДНК путем примированного синтеза с ДНК-полимеразой». Журнал молекулярной биологии. 94 (3): 441–8. Дои:10.1016/0022-2836(75)90213-2. PMID  1100841.
  5. ^ Максам AM, Гилберт В (Февраль 1977 г.). «Новый метод секвенирования ДНК». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 74 (2): 560–4. Bibcode:1977ПНАС ... 74..560М. Дои:10.1073 / пнас.74.2.560. ЧВК  392330. PMID  265521.
  6. ^ Kungliga Vetenskapsakademien (Шведская королевская академия наук) (14 октября 1980 г.). "Нобелевская премия по химии 1980 г.". nobelprize.org (Пресс-релиз). Nobel Media. В архиве с оригинала 31 октября 2018 г.. Получено 14 декабря 2019.
  7. ^ Сангер, Ф. (8 декабря 1980 г.). «Определение нуклеотидных последовательностей в ДНК (Нобелевская лекция)» (PDF). nobelprize.org. Nobel Media. В архиве (PDF) с оригинала 14 декабря 2019 г.. Получено 14 декабря 2019.
  8. ^ Ли Ю., Митаксов В., Ваксман Г. (август 1999 г.). «Дизайн на основе структуры ДНК-полимераз Taq с улучшенными свойствами включения дидезоксинуклеотидов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 96 (17): 9491–6. Bibcode:1999PNAS ... 96.9491L. Дои:10.1073 / пнас.96.17.9491. ЧВК  22236. PMID  10449720.

внешняя ссылка