Точечный блот - Dot blot
А точечный блот (или же слот-блот) - техника в молекулярная биология используется для обнаружения белков. Он представляет собой упрощение вестерн-блот метод, за исключением того, что детектируемые белки сначала не разделяются электрофорез. Вместо этого образец наносится непосредственно на мембрану одним пятном и выполняется процедура блоттинга.
Этот метод предлагает значительную экономию времени, так как хроматография или же гель-электрофорез, и сложные процедуры блоттинга для геля не требуются. Однако он не дает никакой информации о размере целевого белка.[1]
Использует
Идея проведения дот-блоттинга аналогична вестерн-блоттингу, но с преимуществом более высокой скорости и меньшей стоимости.
Дот-блоты также выполняются для проверки связывающих способностей антитела.[2]
Методы
Общий протокол дот-блоттинга включает нанесение 1-2 микролитров образцов на нитроцеллюлоза или же ПВДФ мембрану и дать ей высохнуть на воздухе. Образцы могут быть в виде супернатантов тканевых культур, сыворотки крови, клеточных экстрактов или других препаратов.[3]
Мембрану инкубируют в блокирующем буфере для предотвращения неспецифического связывания. Затем его инкубируют с первичным антителом, а затем с детекторным антителом или с первичным антителом, конъюгированным с детектирующей молекулой (обычно HRP или же щелочная фосфатаза ). После связывания антител мембрану инкубируют с хемилюминесцентный подложка и изображение.
Аппарат
Дот-блот обычно выполняется на кусочке нитроцеллюлозной мембраны или мембраны из ПВДФ. После того, как образцы белка нанесены на мембрану, мембрану помещают в пластиковый контейнер и последовательно инкубируют в блокирующем буфере, растворах антител или промывочном буфере на шейкере. Наконец, для получения хемилюминесцентных изображений кусок мембраны необходимо завернуть в прозрачную пластиковую пленку, заполненную ферментным субстратом.
Аппарат дот-блоттинга с вакуумной системой использовался для облегчения процесса промывки и инкубации за счет использования вакуума для извлечения раствора из-под мембраны, которая собрана между несколькими слоями планшетов для обеспечения хорошего уплотнения между лунками для образцов, удержания отработанного раствора и обеспечить всасывающую силу. Для обнаружения сигнала хемилюминесценции необходимо разобрать устройство, снять мембрану и обернуть ее прозрачной пластиковой пленкой.
Смотрите также
Рекомендации
- ^ «Тестовые блоты, слот-блоты и дот-блоты - иммунодетекция | Bio-Rad». Био-Рад.
- ^ Rupprecht, Kevin R .; Nair, Rad K .; Harwick, Larissa C .; Гроте, Джонатан; Beligere, Gangamani S .; Rege, Sushil D .; Чен, Йон-Йих; Линь, Чжэнь; Фишпо, Джеффри Р. (15 декабря 2010 г.). «Разработка дот-блоттинга для скрининга моноклональных антител к низкомолекулярным лекарствам». Аналитическая биохимия: 160–164. Дои:10.1016 / j.ab.2010.08.003. PMID 20696124.
- ^ «Протокол дот-блоттинга» (PDF).