Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия - Википедия - Fluorescence cross-correlation spectroscopy

Эта статья может быть сбивает с толку или неясно читателям. Пожалуйста, помоги нам прояснить статью. Возможно обсуждение этого вопроса на страница обсуждения. (Декабрь 2010 г.) (Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения)

Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS) был представлен Эйген и Риглер в 1994 г.^[1] и экспериментально реализовано Schwille в 1997 г.^[2] По сути, это расширение флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) с использованием двух разноокрашенных молекул вместо одной. Другими словами, совпадающие флуктуации интенсивности зеленого и красного разных молекул коррелируют, если частицы, помеченные зеленым и красным, движутся вместе через заранее определенный конфокальный объем. В результате FCCS обеспечивает высокочувствительное измерение молекулярных взаимодействий независимо от скорости диффузии. Это важное достижение, учитывая, что скорость диффузии слабо зависит от размера молекулярного комплекса.^[3]

Карикатура с фокусным объемом FCCS

FCCS использует два вида, которые независимо помечены двумя флуоресцентными зондами разного цвета. Эти флуоресцентные зонды возбуждаются и обнаруживаются двумя разными источниками лазерного света и детекторами, обычно обозначенными как «зеленый» и «красный». Обычно конфокальный микроскоп используется для обеспечения перекрытия зеленого и красного фокусных объемов для возбуждения.

Моделирование FCCS, демонстрирующее невзаимодействующие частицы (слева) и смесь взаимодействующих и независимых частиц (справа)

Нормализованная функция взаимной корреляции определена для двух флуоресцентных видов. ${ Displaystyle G}$ и ${ Displaystyle R}$ которые являются независимыми зелеными, G и красными, R каналами, а именно:

${ displaystyle G_ {GR} ( tau) = 1 + { frac { langle delta I_ {G} (t) delta I_ {R} (t + tau) rangle} { langle I_ {G } (t) rangle langle I_ {R} (t) rangle}} = { frac { langle I_ {G} (t) I_ {R} (t + tau) rangle} { langle I_ { G} (t) rangle langle I_ {R} (t) rangle}}}$

где дифференциальные флуоресцентные сигналы ${ displaystyle delta I_ {G}}$ в определенное время, ${ displaystyle t}$ и ${ displaystyle delta I_ {R}}$ во время задержки, ${ Displaystyle тау}$ позже соотносятся друг с другом. В отсутствие спектрального просвечивания функция взаимной корреляции равна нулю для невзаимодействующих частиц. В отличие от FCS, функция взаимной корреляции увеличивается с увеличением числа взаимодействующих частиц.

FCCS в первую очередь используется для измерения биомолекулярных взаимодействий как в живых клетках, так и in vitro.^[4][5] Его можно использовать для измерения простых молекулярных стехиометрий и констант связывания.^[6] Это один из немногих методов, который может предоставить информацию о белок-белковых взаимодействиях в определенное время и в определенном месте в пределах живой клетки. В отличие от флуоресцентный резонансный перенос энергии, у него нет ограничения по расстоянию для взаимодействий. В результате его можно использовать для исследования больших комплексов. Тем не менее, для этого требуется, чтобы комплексы активно диффундировали через фокус микроскопа в относительно короткий промежуток времени (обычно секунды).

Моделирование

Кривые взаимной корреляции моделируются в соответствии с несколько более сложной математической функцией, чем применяемая в FCS. Прежде всего, эффективный наложенный объем наблюдения, в котором каналы G и R образуют единый объем наблюдения, ${ displaystyle V_ {eff, RG}}$ в растворе:

${ displaystyle V_ {eff, RG} = pi ^ {3/2} ( omega _ {xy, G} ^ {2} + omega _ {xy, R} ^ {2}) ( omega _ {z, G} ^ {2} + omega _ {z, R} ^ {2}) ^ {1/2} / 2 ^ {3/2}}$

куда ${ Displaystyle omega _ {ху, G} ^ {2}}$ и${ Displaystyle omega _ {ху, R} ^ {2}}$ - радиальные параметры и ${ displaystyle omega _ {z, G}}$ и${ displaystyle omega _ {z, R}}$ - аксиальные параметры для каналов G и R.

Время диффузии, ${ Displaystyle тау _ {D, GR}}$ для дважды (G и R) флуоресцентных частиц описывается следующим образом:

${ displaystyle tau _ {D, GR} = { frac { omega _ {xy, G} ^ {2} + omega _ {xy, R} ^ {2}} {8D_ {GR}}} }$

куда ${ displaystyle D_ {GR}}$ - коэффициент диффузии дважды флуоресцентной частицы.

Кривая взаимной корреляции, полученная при диффузии дважды меченых флуоресцентных частиц, может быть смоделирована в отдельных каналах следующим образом:

${ Displaystyle G_ {G} ( tau) = 1 + { frac {( Diff_ {k} ( tau) + Diff_ {k} ( tau)) } {V_ {eff, GR} ( + ) ^ {2}}}}$

${ Displaystyle G_ {R} ( tau) = 1 + { frac {( Diff_ {k} ( tau) + Diff_ {k} ( tau)) } {V_ {eff, GR} ( + ) ^ {2}}}}$

В идеальном случае функция взаимной корреляции пропорциональна концентрации дважды меченого флуоресцентного комплекса:

${ displaystyle G_ {GR} ( tau) = 1 + { frac { Diff_ {GR} ( tau)} {V_ {eff} ( + ) ( + )}}}$

с ${ displaystyle Diff_ {k} ( tau) = { frac {1} {(1 + { frac { tau} { tau _ {D, i}}}) (1 + a ^ {- 2 } ({ frac { tau} { tau _ {D, i}}}) ^ {1/2}}}}$

Амплитуда взаимной корреляции прямо пропорциональна концентрации двухкомпонентных (красных и зеленых) видов. ^[7]

Смотрите также

• Динамическое рассеяние света
• Флуоресцентная спектроскопия
• Коэффициент диффузии

Рекомендации

внешняя ссылка

• Кросс-корреляция флуоресценции (FCCS) (Becker & Hickl GmbH, веб-страница)