Ник перевод - Nick translation

Ник перевод[1] (или же перевод головы), разработанный в 1977 году Питером Ригби и Полом Бергом, представляет собой маркировка техника в молекулярная биология в котором ДНК-полимераза I используется для замены некоторых нуклеотидов ДНК последовательность с их мечеными аналогами, создавая меченую последовательность ДНК, которую можно использовать в качестве зонда в флуоресцентная гибридизация in situ (РЫБА) или промокание техники. Его также можно использовать для радиоактивная маркировка.[2]

Этот процесс называется ник-трансляцией, потому что обрабатываемая ДНК обрабатывается ДНКазой для образования одноцепочечных «разрывов». Далее следует замена на никовских сайтах на ДНК-полимераза I, что удлиняет 3 'гидроксильный конец, удаляя нуклеотиды за счет 5'-3 'экзонуклеазной активности, заменяя их на дНТФ. Чтобы радиоактивно пометить фрагмент ДНК для использования в качестве зонда в процедурах блоттинга, один из включенных нуклеотидов, представленных в реакции, радиоактивно метят в альфа фосфатная позиция. Точно так же вместо флуорофора можно присоединить для флуоресцентного мечения или антиген для иммунодетекции. Когда ДНК-полимераза I в конечном итоге отделяется от ДНК, она оставляет еще одну щель в фосфатном остове. Ник "переведен" на некоторое расстояние в зависимости от процессивность полимеразы. Этот ник может быть запечатан ДНК-лигаза, или его 3'-гидроксильная группа может служить в качестве матрицы для дальнейшей активности ДНК-полимеразы I. Запатентованные смеси ферментов коммерчески доступны для выполнения всех этапов процедуры за одну инкубацию.

Ник-трансляция может вызвать разрывы двухцепочечной ДНК, если ДНК-полимераза I встречает другой разрыв на противоположной цепи, в результате чего образуются два более коротких фрагмента. Это не влияет на характеристики меченого зонда при гибридизации in situ.

Рекомендации

  1. ^ Ригби П. У., Дикманн М., Родос С., Берг П. (июнь 1977 г.). «Маркировка дезоксирибонуклеиновой кислоты для высокой специфической активности in vitro путем ник-трансляции ДНК-полимеразой I». J. Mol. Биол. 113 (1): 237–51. Дои:10.1016/0022-2836(77)90052-3. PMID  881736.
  2. ^ Мэтью К.Г. (1985). «Мечение ДНК методом ник-трансляции». Нуклеиновые кислоты. Методы Мол. Биол. 2. С. 257–61. Дои:10.1385/0-89603-064-4:257. ISBN  0-89603-064-4. PMID  21374202.