Секвенирование лигированием - Sequencing by ligation

Секвенирование лигированием это Секвенирование ДНК метод, использующий фермент ДНК-лигаза определить нуклеотид присутствует в данной позиции в последовательности ДНК. В отличие от наиболее популярных в настоящее время методов секвенирования ДНК, этот метод не использует ДНК-полимеразу для создания второй цепи. Вместо этого чувствительность к несоответствию фермента ДНК-лигазы используется для определения базовой последовательности целевой молекулы ДНК.

Обработать

ДНК-лигаза - это фермент который соединяет концы молекул ДНК. Хотя обычно изображается как соединение двух пар концов одновременно, как в перевязка из рестрикционный фермент фрагментов, лигаза также может соединять концы только на одной из двух цепей (например, когда другая цепь уже является непрерывной или не имеет концевой фосфат необходимо для перевязки). ДНК-лигаза чувствительна к структуре ДНК и имеет очень низкую эффективность при несовпадении оснований двух цепей.

Секвенирование путем лигирования зависит от чувствительности ДНК-лигазы к несовпадениям при спаривании оснований. Секвенируемая молекула-мишень представляет собой одну цепь с неизвестной последовательностью ДНК, фланкированной по крайней мере на одном конце известной последовательностью. Вводится короткая «якорная» нить, чтобы связать известную последовательность.

Смешанный пул зонда олигонуклеотиды затем вводится (восемь или девять оснований), маркируется (обычно флуоресцентными красителями) в соответствии с положением, которое будет секвенировано. Эти молекулы гибридизуются с целевой последовательностью ДНК, следующей за якорной последовательностью, и ДНК-лигаза предпочтительно присоединяет молекулу к якорю, когда ее основания совпадают с неизвестной последовательностью ДНК. Основываясь на флуоресценции, производимой молекулой, можно сделать вывод об идентичности нуклеотида в этом положении в неизвестной последовательности.

Олигонуклеотидные зонды также могут быть сконструированы с расщепляемыми связями, которые можно расщеплять после идентификации метки. Это и удалит метку, и регенерирует 5'-фосфат на конце лигированного зонда, подготовив систему к еще одному раунду лигирования. Этот цикл можно повторить несколько раз, чтобы прочитать более длинные последовательности.[1] Это последовательность каждого N-го основания, где N - длина зонда, оставшегося после расщепления. Для секвенирования пропущенных положений якорь и лигированные олигонуклеотиды могут быть удалены с целевой последовательности ДНК, и другой раунд секвенирования путем лигирования начинается с якоря на одно или несколько оснований короче.

Более простой, хотя и более ограниченный метод заключается в проведении повторных раундов одного лигирования, когда метка соответствует другому положению в зонде, с последующим удалением якоря и лигированного зонда.[2][3]

Секвенирование путем лигирования может происходить в любом направлении (5'-3 'или 3'-5') в зависимости от того, какой конец олигонуклеотидов зонда блокируется меткой. Направление 3'-5 'более эффективно для выполнения нескольких циклов лигирования. Обратите внимание, что это противоположное направление методам секвенирования на основе полимеразы.

Ограничения

Сообщалось, что это секвенирование методом лигирования вызывает проблемы с секвенированием палиндромных последовательностей.[4]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ S. C. Macevicz, патент США 5750341, подана в 1995 г.
  2. ^ Уайтли (1988). «Обнаружение специфических последовательностей в нуклеиновых кислотах». Патент США 4,883,750.
  3. ^ Дж. Шендуре, Дж. Дж. Поррека, Н. Реппас, X. Лин, J.Pe McCutcheon, A.M. Розенбаум, М.Д.Ванг, К. Чжан, Р.Д. Митра и Г.М. Церковь (2005). "Точный мультиплекс Секвенирование полонии эволюционировавшего бактериального генома ". Наука. 309 (5741): 1728–1732. Bibcode:2005Наука ... 309.1728S. Дои:10.1126 / science.1117389. PMID  16081699.CS1 maint: несколько имен: список авторов (ссылка на сайт)
  4. ^ Ю-Фэн ​​Хуан, Шэн-Чунг Чен, И-Шиен Чан, Цзы-Хан Чен & Куо-Пин Чиу (2012). «Палиндромная последовательность препятствует механизму секвенирования путем лигирования». BMC Системная биология. 6 Приложение 2: S10. Дои:10.1186 / 1752-0509-6-S2-S10. ЧВК  3521181. PMID  23281822. Cite имеет пустой неизвестный параметр: | месяц = (Помогите)CS1 maint: несколько имен: список авторов (ссылка на сайт)