Культура клеток на границе раздела воздух-жидкость - Air-liquid interface cell culture

Псевдостратифицированный эпителий трахеи клеточной культуры ALI призван воссоздать in vitro

Культура клеток на границе раздела воздух и жидкость (Али) является методом культура клеток при котором базальные стволовые клетки растут, их базальные поверхности контактируют со средой, а верхняя часть клеточного слоя подвергается воздействию воздуха. Затем клетки поднимают и среду заменяют до развития мукоцилиарного фенотипа псевдостратифицированный эпителий, похожий на трахею эпителий.[1][2]

Этот метод культивирования клеток предназначен для изучения фундаментальных аспектов респираторного эпителия, таких как передача сигналов от клетки к клетке, моделирование заболеваний и респираторная регенерация.[1][2]

Культура клеток на границе раздела воздух-жидкость сравнивается со стандартными методами культивирования клеток, специально стремясь восстановить псевдостратифицированную полосатость дыхательных путей. in vitroи стремясь поддерживать нишу дыхательных путей (сверху вниз) 1) воздуха, 2) псевдостратифицированного эпителия и 3) жидкой среды. Стандартные процессы культивирования клеток либо не связаны с дыхательными путями, либо связаны с системой органов, требующей других средств поддержания клеток. in vitro.

Протокол

Протокол для межфазной культуры воздух-жидкость основан на двух ключевых этапах: выделение эпителиальных клеток из организма и культивирование этих клеток.

Изоляция

Органы с эпителиальными клетками изолированы[1] (рассекают) и помещают в PBS для очистки любых примесей, и эти изолированные органы переваривают с использованием трипсин. После переваривания ингибитор РОК (Rho-ассоциированная киназа ингибитор) добавляется для предотвращения клеточного апоптоза изолированных клеток. Остается переваренное клеточное содержимое, смешанное с тканью; проназа /ДНКаза добавляется для очистки мертвого клеточного материала, а также любого оставшегося белкового материала. Полученный материал мелко измельчают в среде, и отдельные изолированные образцы клеток помещают в соответственно отмеченные микроцентрифуга пробирки и встряхивают при 37 ° C в течение 30-40 минут. После того, как клетки инкубируются, их высевают на мембраны трансвеллеров для роста.

Культура

Планшетные клетки с SABM (базальная среда для малых дыхательных путей) для обогащения клеток питательными веществами с целью роста и, в конечном итоге, дифференциация.[1] После посева клеток их выращивают в течение 3–7 дней при тщательном наблюдении (при смене среды каждый день) до достижения желаемого слияния.

Совсем недавно было проведено исследование В пробирке Генерация пневмоцитов типа II, инициированная стволовыми клетками CD34 (+) человека, была точно продемонстрирована с помощью метода культивирования клеток на границе раздела воздух и жидкость.[3]

Использование в научных исследованиях

Культуры на границе раздела воздух-жидкость используются во многих стволовая клетка исследования, направленные на воссоздание псевдостратифицированного эпителия in vitro. Эти исследования могут способствовать новым открытиям по различным темам:

Рак

В моделировании рак и различных других заболеваний, стволовые клетки в базальном слое эпителия трахеи (базальные стволовые клетки) были выделены и использованы при разработке 3D органоиды которые можно использовать для различных исследований, в том числе опухоль исследования. Используемый метод культивирования клеток включает выделение клеток для культивирования с факторами роста для роста с течением времени. После того, как клетки выросли, их смешали с Матригель и культивировали с образованием трехмерных органоидов.[4][5]

Рост / дифференциация клеток

При моделировании псевдостратифицированного эпителия in vitro, было проведено больше клеточных исследований, чтобы определить природу клеток - их пути дифференцировки, их механизм роста, их механизм восстановления / ответа в состоянии после травмы. Одно недавнее исследование показало, что дифференцированные клетки в респираторном эпителии (секреторные клетки и прежде всего реснитчатые клетки) могут дедифференцироваться до своего наивного статуса и снова стать стеблевыми.[1][5]

Адаптированный протокол: поддержание стволовых свойств базальных стволовых клеток

В качестве адаптации к протоколу культивирования интерфейса воздух-жидкость были разработаны вспомогательные протоколы с использованием структуры ALI для поддержания свойств наивных стволовых клеток в течение длительных периодов времени.[6]

использованная литература

  1. ^ а б c d е Тата, Пурушотхама Рао; Моу, Хунмэй; Пардо-Саганта, Ана; Чжао, Руи; Прабху, Мифили; Закон, Брэндон М .; Винарский, Владимир; Cho, Josalyn L .; Бретон, Сильви (ноябрь 2013 г.). «Дедифференцировка коммитированных эпителиальных клеток в стволовые клетки in vivo». Природа. 503 (7475): 218–223. Дои:10.1038 / природа12777. ISSN  1476-4687. ЧВК  4035230. PMID  24196716.
  2. ^ а б «Культура на границе раздела воздух-жидкость для респираторных исследований». www.stemcell.com. Получено 2018-03-30.
  3. ^ Шрикантх, Локанатан; Венкатеш, Катари; Сунита, Манне Мудху; Кумар, Пасупулети Сантош; Чандрасекар, Чодимелла; Венгамма, Бхума; Шарма, Потукути Венката Гурунадха Кришна (февраль 2016 г.). «Создание пневмоцитов типа II in vitro может быть инициировано в человеческих CD34 (+) стволовых клетках». Письма о биотехнологии. 38 (2): 237–242. Дои:10.1007 / s10529-015-1974-2. ISSN  1573-6776. PMID  26475269.
  4. ^ Рок, Джейсон Р .; Onaitis, Mark W .; Роулинз, Эмма Л .; Лу, Юнь; Кларк, Шерил П .; Сюэ, Ян; Рэнделл, Скотт Х .; Хоган, Бригид Л. М. (04.08.2009). «Базальные клетки как стволовые клетки трахеи мыши и эпителия дыхательных путей человека». Труды Национальной академии наук. 106 (31): 12771–12775. Дои:10.1073 / pnas.0906850106. ISSN  0027-8424. ЧВК  2714281. PMID  19625615.
  5. ^ а б Тата, Пурушотхама Рао; Раджагопал, Джаярадж (2017-03-01). «Пластичность в легких: создание и разрушение идентичности клеток». Развитие. 144 (5): 755–766. Дои:10.1242 / dev.143784. ISSN  0950-1991. ЧВК  5374348. PMID  28246210.
  6. ^ Моу, Хунмэй; Винарский, Владимир; Тата, Пурушотхама Рао; Бразаускас, Карисса; Choi, Soon H .; Crooke, Adrianne K .; Чжан, Бин; Соломон, Джордж М .; Тернер, Бретт (2016). «Двойное подавление сигналов SMAD делает возможным долгосрочное расширение разнообразных базальных эпителиальных клеток». Стволовая клетка клетки. 19 (2): 217–231. Дои:10.1016 / j.stem.2016.05.012. ЧВК  4975684. PMID  27320041.