Анализ рестрикции амплифицированной рибосомной ДНК - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

Рестрикционный анализ амплифицированной рДНК (рибосомной ДНК) является расширением методики RFLP (полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ) к гену, кодирующему малая (16s) рибосомная субъединица из бактерии. Методика включает ферментативную амплификацию с использованием праймеров, направленных на консервативные области на концах гена 16s, с последующим перевариванием с использованием тетракуттера. Ферменты рестрикции. Полученный образец считается представительным для анализируемого вида. Паттерны, полученные с помощью нескольких рестрикционных ферментов, можно использовать для филогенетической характеристики культивируемых изолятов и генов 16s, полученных путем клонирования от сообщества. ДНК[1]

Обоснование и процедура ARDRA

Vaneechoutte и другие.,[2] были одними из первых, кто применил этот метод и применил его для характеристики видов Mycobacterium и видов Acinetobacter. [3] Во многих других исследованиях ARDRA применялась для различных таксонов бактерий. Основываясь на простой формуле для частоты случайного появления сайта рестрикции, последовательность из 4 пар оснований может встречаться один раз каждые 256 пар оснований. Рестрикционный фермент, имеющий сайт узнавания более 4 пар оснований, не будет иметь значения по отношению к гену размером приблизительно 1500 пар оснований, такому как ген, кодирующий рибосомную субъединицу 16s. На рынке доступен ряд ферментов рестрикции тетракуттер. Для статистической значимости, по крайней мере, три рестрикционных фермента должны использоваться для анализа, чтобы преодолеть вероятность того, что определенные рестрикционные ферменты дадут аналогичные картины для не столь несвязанных организмов.

Анализируемый ампликон должен предпочтительно соответствовать размеру более 1000 пар оснований исключительно для того, чтобы выявить большую вероятность сайта рестрикции. Ампликоны перед перевариванием желательно очистить. Это можно сделать с помощью множества имеющихся в продаже наборов для очистки. Следует проявлять осторожность при выборе рестрикционных ферментов. Некоторые рестрикционные ферменты распознают одни и те же сайты и не могут вносить продуктивный вклад в анализ. Рекомендуется ночная переваривание (10–16 часов) около 300-500 нг ампликонной ДНК в системе на 20 мкл с 4-5 единицами рестрикционного фермента вместе с рекомендованным буфером при заданной температуре. После расщепления реакцию останавливают, и весь процесс переваривания проводят в 2-3% агарозном геле при 90-100 В. Гель должен иметь длину, позволяющую правильно разделить второстепенные фрагменты, от 100 до 200 п.н.

Анализ паттернов выполняется с помощью методов, используемых для RAPD узоры. Кластеры родственных бактерий можно представить в виде кладограмма или филограмма. После первоначального анализа программа многомерного анализа, такая как NT-SYS[4] или ПРОШЛОЕ[5] предоставление сведений о наличии или отсутствии полос, отмеченных цифрами 1 (наличие) и 0 (отсутствие). Данные могут быть впоследствии использованы для создания филограмма или кладограмма. Таблицу данных можно использовать для построения филогенетического дерева, которое указывало бы на родство организмов на основе паттерна рестрикции, полученного от их соответствующих генов 16s. Также доступно коммерческое программное обеспечение для анализа этих закономерностей, наиболее часто используются пакеты GelCompar II и BioNumerics.

использованная литература

  1. ^ Sklarz, M., R. Angel, O. Gillor и MIM. Соарес. 2009. Оценка анализа рестрикционного анализа амплифицированной рДНК для идентификации бактериальных сообществ. Муравей ван Левенгук 96: 659–664.
  2. ^ М. Ваничутт, Х. Де Бенхауэр, Г. Клейс, Г. Фершреген, А. Де Рук, Н. Паэпе, А. Элайчуни и Ф. Портаэлс. 1993. Идентификация видов Mycobacterium с помощью рестрикционного анализа амплифицированной рДНК. J. Clin. Microbiol. 31: 2061–2065.
  3. ^ М. Ваничутт, Л. Дейксхорн, И. Тьернберг, А. Элайчуни, П. Де Вос, Г. Клэйс и Г. Фершреген. 1995. Идентификация геномных видов Acinetobacter с помощью рестрикционного анализа амплифицированной рибосомной ДНК. J. Clin. Microbiol. 33: 11–15.
  4. ^ Программное обеспечение Exeter: NTSYSpc http://www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html
  5. ^ Палеонтологическая статистика: http://folk.uio.no/ohammer/past/