Анализ хемотаксиса - Chemotaxis assay

Процесс хемотаксиса можно продемонстрировать с помощью анализа капиллярной трубки (показано выше). Подвижные прокариоты могут ощущать химические вещества в окружающей среде и соответственно изменять свою подвижность. Когда химикатов нет, движение происходит совершенно случайно. Когда присутствует репеллент или аттрактант, подвижность изменяется; пробеги становятся длиннее, а кувырки становятся реже, так что может быть достигнуто чистое движение к химикату или от него. Чистое движение можно увидеть в стакане, где бактерии скапливаются вокруг аттрактанта и вдали от репеллента. Стакан, использованный на этой иллюстрации, взят из Wikimedia Commons - "Лабораторная посуда - стакан "пользователя Amanda44.

Анализы хемотаксиса экспериментальные инструменты для оценки хемотаксический способность прокариотический или же эукариотический Ячейки были разработаны самые разнообразные методы. Некоторые техники качественный - позволяя исследователю приблизительно определить хемотаксическое сродство клетки к аналиту - в то время как другие количественный, что позволяет точно измерить это сродство.

Контроль качества

В общем, наиболее важным условием является калибровка время инкубации анализа как на модельную клетку, так и на лиганд, подлежащий оценке. Слишком короткое время инкубации приводит к отсутствию клеток в образце, а слишком долгое время нарушает градиенты концентрации и измеряет больше хемокинетический чем хемотаксический ответы.

Наиболее часто используемые техники сгруппированы в две основные группы:

Методы агаровой чашки

Анализы хемотаксиса с чашками с агаром

Этот способ оценки касается агар-агар или же желатин содержащие полутвердые слои, сделанные до эксперимента. В слое вырезают небольшие лунки, которые заполняют клетками и исследуемым веществом. Клетки могут мигрировать в направлении химического градиента в полутвердом слое или под слоем. Некоторые варианты этой техники касаются также лунок и параллельных каналов, соединенных разрезом в начале эксперимента (метод PP). Радиальное расположение PP-техники (3 или более каналов) дает возможность сравнивать хемотаксическую активность различных популяций клеток или изучать предпочтения между лигандами.[1]

Подсчет клеток: клетки с положительным ответом могут быть подсчитаны от передней части мигрирующих клеток, после окрашивания или в естественных условиях в световом микроскопе.

Двухкамерные техники

Камерные анализы хемотаксиса

Камера Бойдена

Камеры, изолированные фильтрами, являются подходящими инструментами для точного определения хемотаксического поведения. Пионерский тип этих камер был построен Бойденом.[2] Подвижные клетки помещаются в верхнюю камеру, а жидкость, содержащая исследуемое вещество, заливается в нижнюю. Размер исследуемых подвижных клеток определяет размер пор фильтра; Важно выбрать диаметр, который позволяет осуществлять активную трансмиграцию. Для моделирования in vivo условиях, некоторые протоколы предпочитают покрытие фильтра молекулами внеклеточный матрикс (коллаген, эластин и др.) Эффективность измерений была увеличена за счет разработки многолуночных камер (например, NeuroProbe), где параллельно оцениваются 24, 96, 384 образца. Преимущество этого варианта заключается в том, что несколько параллелей исследуются в идентичных условиях.

Мостовые камеры

В другом варианте камеры соединены бок о бок по горизонтали (камера Зигмонда).[3] или в виде концентрических колец на слайде (камера Данна)[4] Градиент концентрации развивается на узкой соединительной перемычке между камерами, и количество мигрирующих клеток также подсчитывается на поверхности перемычки с помощью светового микроскопа. В некоторых случаях мост между двумя камерами заполнен агаром, и клетки должны "скользить "в этом полутвердом слое.

Капиллярные методы

Некоторые капиллярные методы предусматривают также расположение камер, однако между клетками и исследуемым веществом нет фильтра.[5] Количественные результаты достигаются с помощью многолуночного типа этого зонда с использованием 4-8-12-канальных пипеток. Точность дозатора и увеличенное количество параллельно проходящих проб - большое преимущество этого теста.[6]

Подсчет клеток: клетки с положительным ответом подсчитываются из нижней камеры (длительное время инкубации) или из фильтра (короткое время инкубации). Для обнаружения клеток общие методы окрашивания (например, трипановый синий ) или специальные зонды (например, определение mt-дегидрогеназы с помощью анализа MTT). Помечено (например, флуорохромы ) клетки также используются, в некоторых анализах клетки метят во время трансмиграции через фильтр.

Другие техники

Другие методы анализа хемотаксиса

Помимо вышеупомянутых двух наиболее часто используемых семейств методов, был разработан широкий спектр протоколов для измерения хемотаксической активности. Некоторые из них носят только качественный характер, например, тесты на агрегацию, когда небольшие кусочки агара или фильтров помещаются на предметное стекло и измеряется скопление клеток вокруг.

В другом полуколичественном методе на клетки накладывают тестируемое вещество, и изменения в опалесценция первоначально бесклеточного отсека регистрируют во время инкубации.[7]

Третий часто используемый качественный метод - это T-лабиринт и его приспособления для микропланшетов. В исходном варианте просверленная в колышек емкость заполнена ячейками. Затем колышек закручивается, и клетки соприкасаются с двумя другими емкостями, заполненными другими веществами. Инкубацию останавливают, переставляя стержень, и подсчитывают количество клеток в контейнерах.[8]

Также в последнее время[когда? ] микрофлюидные устройства используются все чаще и чаще для количественного и точного определения хемотаксиса.[9][10][11]

Рекомендации

  1. ^ Кохидаи Л. (1995). «Метод определения хемоаттракции у Tetrahymena pyriformis». Curr Microbiol. 30 (4): 251–3. Дои:10.1007 / BF00293642. PMID  7765899. S2CID  28989380.
  2. ^ Бойден, С.В. (1962). «Хемотаксический эффект смесей антитела и антигена на полиморфноядерные лейкоциты». J Exp Med. 115 (3): 453–66. Дои:10.1084 / jem.115.3.453. ЧВК  2137509. PMID  13872176.
  3. ^ Зигмонд С.Х. (1977). «Способность полиморфноядерных лейкоцитов ориентироваться в градиентах хемотаксических факторов». Журнал клеточной биологии. 75 (2): 606–616. CiteSeerX  10.1.1.336.4181. Дои:10.1083 / jcb.75.2.606. ЧВК  2109936. PMID  264125.
  4. ^ Зича Д .; Dunn G.A .; Браун А.Ф. (1991). «Новая камера хемотаксиса прямого обзора». J Cell Sci. 99: 769–75. PMID  1770004.
  5. ^ Leick V .; Хелле Дж. (1983). «Количественный анализ хемотаксиса инфузорий». Анальный биохим. 135 (2): 466–9. Дои:10.1016/0003-2697(83)90713-3. PMID  6660520.
  6. ^ Кохидаи, Л., Лемберковиц, Э. и Csaba, G. (1995). «Молекулярно-зависимые хемотаксические реакции Tetrahymena pyriformis, вызванные летучими маслами». Acta Protozool. 34: 181–5.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  7. ^ Koppelhus U .; Hellung-Larsen P .; Лейк В. (1994). «Улучшенный количественный анализ хемокинеза в Tetrahymena». Биол Бык. 187 (1): 8–15. Дои:10.2307/1542160. JSTOR  1542160. PMID  7918798.
  8. ^ Ван Хаутен Дж .; Martel E .; Каш Т. (1982). «Кинетический анализ хемокинеза Paramecium». J Protozool. 29 (2): 226–30. Дои:10.1111 / j.1550-7408.1982.tb04016.x. PMID  7097615.
  9. ^ Сеймур Дж. Р .; Дж. Р. Ахмед; Маркос С. Р. (2008). «Анализ микрожидкостного хемотаксиса для изучения микробного поведения в диффузных участках питательных веществ». Лимнология и океанография: методы. 6 (9): 477–887. Дои:10.4319 / лом.2008.6.477. HDL:10453/8517.
  10. ^ Zhang C .; {i {} et al.} (2013 г.). «Чувствительный анализ хемотаксиса с использованием нового микрофлюидного устройства». {i {} BioMed Research International}. 8: 8211–8.
  11. ^ Ахмед Т .; химизу Т. С .; Стокер Р. (2010). «Микрофлюидика для бактериального хемотаксиса». {i {} Интегративная биология}. 2 (11–12): 604–29. Дои:10.1039 / c0ib00049c. HDL:1721.1/66851. PMID  20967322.

внешняя ссылка