Гибридизация колоний - Colony hybridization

Гибридизацию применяют к нуклеиновой кислоте, высвобожденной из микробных колоний и меченной зондом для обнаружения такими методами, как ультрафиолетовый свет или авторадиография. Это отлично подходит для проверки клонов.
Процесс гибридизации колоний: рост колоний клеток, репликация на фильтре, гибридизация и идентификация желаемых колоний.

Гибридизация колоний это метод выбора бактериальные колонии с желаемым гены.[1]Этот метод был открыт Майкл Грюнштейн и Дэвид С. Хогнесс. [2]

Метод

Гибридизация колоний начинается с культивирования малонаселенных бактериальных колоний на чашке с питательным агаром. Эти колонии симметрично воспроизводятся на нитроцеллюлоза фильтровать прямым контактом, после чего клетки на мембране фильтра лизированный и их ДНК денатурируется, что позволяет ему связываться с фильтром. Эти кластеры ДНК затем гибридизированный к желаемому радиоактивно меченному РНК или же ДНК зонд (выбранный заранее) и проверенный авторадиография. Кластеры ДНК, которые демонстрируют желаемый ген, затем сопоставляются с соответствующими (живыми) бактериальными колониями, которые могут быть изолированы для дальнейшего роста и экспериментов.[2]


Определение гибридизации колоний: -Гибридизация колоний - это «метод блоттинга», при котором бактериальные клетки переносятся из твердой питательной среды на абсорбирующий материал. Гибридизацию колоний можно определить как метод выделения конкретных последовательностей ДНК или генов из бактериальных клеток, содержащих гибридную ДНК, с помощью нитроцеллюлозного мембранного фильтра. Затем передающая среда проходит несколько химических и физических обработок.

Переносная среда для гибридизации колоний: -Нитроцеллюлозная фильтровальная бумага является переносящей средой для гибридизации колоний, которая образует копии мастер-планшета. Нитроцеллюлоза действует как мембрана, которая содержит точные копии гена эталонной пластины. Нитроцеллюлозная фильтровальная бумага действует как «промокательная прокладка».

Гибридизация колоний включает следующие этапы:

Подготовка мастер-планшета: -Сначала инокулируйте суспензию бактериальных клеток на твердой агаризованной среде, чтобы приготовить мастер-планшет. После инокуляции количество бактериальных колоний будет развиваться с различными плазмидами, которые называют «эталонной или контрольной чашкой».

Формирование реплик на нитроцеллюлозном фильтре: -Затем перенесите бактериальные клетки с мастер-планшета на мембрану или отфильтруйте с помощью «нитроцеллюлозного фильтра». Прижмите нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу к поверхности мастер-планшета. Это сжатие фильтрующей мембраны будет формировать реплики или копии бактериальных клеток, как на мастер-планшете.

Обработка фильтрующей среды SDS: -После этого обработайте нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу детергентом, таким как SDS (додецилсульфат натрия), чтобы лизировать бактериальные клетки.

Обработка фильтрующей среды щелочью: - Обработайте фильтрующую среду щелочью, например гидроксидом натрия, чтобы разделить ДНК на отдельные нити.

Фиксация ДНК на фильтрующей среде: -Чтобы зафиксировать ДНК на нитроцеллюлозной фильтровальной бумаге, либо запекайте фильтровальную бумагу при 80 градусах Цельсия, либо подвергайте ее воздействию ультрафиолетового света.

Добавление радиоактивного зонда: -Гибридизируйте нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу, содержащую отпечатки плазмидной ДНК, путем добавления радиоактивного зонда РНК. Этот радиоактивный РНК-зонд будет кодировать желаемую последовательность гена из бактериальных клеток.

Промывка и авторадиография: - Промойте фильтровальную бумагу, чтобы удалить несвязанные частицы зонда. После этого выставьте нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу на рентгеновскую пленку методом, называемым «Авторадиография». Колония, которая появится после авторадиографии, будет называться «авторадиограммой», которая несет интересующие гены.

Идентификация желаемого гена: -Затем сравните полученную авторадиограмму с эталонным планшетом, чтобы идентифицировать колонии, содержащие интересующий ген.

Клетки, которые содержат желаемый ген, могут расти в жидкой среде и могут дополнительно обрабатываться для выделения рекомбинантной плазмидной ДНК.

Заключение: - Таким образом, мы можем сделать вывод, что метод гибридизации колоний - это «метод скрининга», в котором используется радиоактивный зонд. Затем радиоактивно меченый зонд скринирует или изолирует конкретный ген из числа бактериальных колоний.

Рекомендации

  1. ^ Редей, Джордж П. (16 июля 2016 г.). Энциклопедия генетики, геномики, протеомики и информатики. Springer Нидерланды. п. 392. Дои:10.1007/978-1-4020-6754-9. ISBN  978-1-4020-6754-9.
  2. ^ а б Грюнштейн, М; Хогнесс, Д. С. (1975). «Гибридизация колоний: метод выделения клонированных ДНК, содержащих определенный ген». Труды Национальной академии наук. 72 (10): 3961–3965. Bibcode:1975PNAS ... 72.3961G. Дои:10.1073 / pnas.72.10.3961. ЧВК  433117. PMID  1105573.