Криофиксация - Cryofixation

Криофиксация это метод фиксации или стабилизации биологических материалов в качестве первого шага в подготовке образцов для электронная микроскопия и криоэлектронная микроскопия.[1] Типичные образцы для криофиксации включают небольшие образцы растение или же животное ткань, клеточные суспензии микроорганизмов или культивированные клетки, приостановки вирусы или же вирусные капсиды и образцы очищенных макромолекулы, особенно белки.[2][3]

Погружное замораживание

Метод предполагает сверхбыстрое охлаждение небольших образцов тканей или клеток до температуры жидкости. азот (-196 ° C) или ниже, останавливая все движения и метаболическую активность и сохраняя внутреннюю структуру путем замораживания всей жидкости фазы твердый. Обычно образец погружают в жидкий азот или в жидкость. этан или жидкость пропан в емкости, охлаждаемой жидким азотом. Конечная цель - так быстро заморозить образец (на 104 до 106 K в секунду), что кристаллы льда не могут образовываться или не могут вырасти достаточно большими, чтобы вызвать повреждение образца ультраструктура. Формирование образцов, содержащих образцы в аморфный лед это "Святой Грааль «биологической криомикроскопии.[нужна цитата ]

На практике очень трудно достичь достаточно высокой скорости охлаждения, чтобы аморфный лед в образцах более нескольких микрометры по толщине. Для этого погрузите образец в жидкий азот с температурой кипения (-196 ° C).[4] не всегда замораживает образец достаточно быстро по нескольким причинам. Во-первых, жидкий азот быстро закипает вокруг образца, образуя пленку изолирующего материала. N
2 газ, который замедляет теплопередачу криогенной жидкости, известный как Эффект Лейденфроста. Скорость охлаждения можно улучшить, перекачав жидкий азот с пластинчато-роторный вакуумный насос за несколько десятков секунд перед тем, как погрузить в нее образец. Это понижает температуру жидкого азота ниже точки кипения, так что, когда образец погружается в него, он плотно обволакивает образец на короткий период времени и более эффективно отводит от него тепло. Еще более быстрое охлаждение можно получить, погрузив образцы в жидкость. пропан или же этан (этан оказался более эффективным)[5] остыли очень близко к их точки плавления с использованием жидкого азота[6] или ударяя образец о полированные металлические поверхности, охлаждаемые жидким азотом, сделанные из медь или же серебро.[7] Во-вторых, два свойства самой воды препятствуют быстрому криофиксации крупных образцов.[8] В теплопроводность льда очень мало по сравнению с металлы, и попуски в воду скрытая теплота плавления поскольку он замерзает, преодолевая быстрое охлаждение у образцов толщиной более нескольких микрометров.

Заморозка под высоким давлением

Высокое давление помогает предотвратить образование крупных кристаллов льда. Самостоятельное быстрое замораживание (SPRF) может использовать множество различных криогенов, что недавно было рекламировано как привлекательная и недорогая альтернатива замораживанию под высоким давлением (HPF).[9]

Рекомендации

  1. ^ Пильхофер, Мартин; Ладинский, Марк С .; McDowall, Alasdair W .; Дженсен, Грант Дж. (2010). «Бактериальный ТЕМ». Методы клеточной биологии. Методы клеточной биологии. 96: 21–45. Дои:10.1016 / S0091-679X (10) 96002-0. ISBN  9780123810076. ISSN  0091-679X. PMID  20869517.
  2. ^ Эхлин П. (1992). Низкотемпературная микроскопия и анализ. Нью-Йорк: Plenum Publishing Corporation.
  3. ^ Dubochet J, Адриан M, Чанг JJ, Homo JC, Lepault J, McDowall AW, Schulz P (1988). «Криоэлектронная микроскопия застеклованных образцов» (PDF). Ежеквартальный обзор биофизики. 21 (2): 129–228. Дои:10.1017 / s0033583500004297. PMID  3043536.
  4. ^ Баттерсби Б.Дж., Шарп Д.С., Уэбб Р.И., Барнс Г.Т. (1994). «Стеклование водных суспензий из контролируемой среды для электронной микроскопии: улучшенное устройство погружного охлаждения». Журнал микроскопии. 176 (2): 110–120. Дои:10.1111 / j.1365-2818.1994.tb03505.x.
  5. ^ Райан, Кейт П. (1992). «Криофиксация тканей для электронной микроскопии: обзор методов погружного охлаждения» (PDF). Сканировать. Microsc. 6 (3): 715–743.
  6. ^ Лысый WB (1984). «Относительная эффективность криогенных жидкостей, используемых в быстром охлаждении криогенных образцов». Журнал микроскопии. 134 (3): 261–270. Дои:10.1111 / j.1365-2818.1984.tb02519.x.
  7. ^ Эллисон Д.П., Доу С.С., Рорвик М.С. (1987). «Конструкция и работа простого и недорогого устройства шоковой заморозки для электронной микроскопии». Журнал микроскопии. 147 (Чт 1): 103–108. Дои:10.1111 / j.1365-2818.1987.tb02822.x. PMID  3305955.
  8. ^ Лысый WB (1987). Количественная криофиксация. Бристоль и Филадельфия: Адам Хильгер.
  9. ^ Леуниссен Ян Л.М. и Йи Х. (2009). «Быстрая заморозка под давлением (SPRF): новый метод криофиксации для подготовки образцов в электронной микроскопии». J. Microsc. 235 (1): 25–35. Дои:10.1111 / j.1365-2818.2009.03178.x. PMID  19566624. Архивировано из оригинал на 2013-01-05.