ФЛАГ-тег - Википедия - FLAG-tag

ФЛАГ-тег, или же Октапептид FLAG, или же Эпитоп FLAG, представляет собой полипептид белковая метка которые можно добавить к белку, используя рекомбинантная ДНК технологии, имеющий мотив последовательности DYKDDDDK (где D =аспарагиновая кислота, Y =тирозин, а K =лизин ).[1] Это один из самых специфических тегов[2] и это искусственный антиген, к которому были разработаны специфические моноклональные антитела с высокой аффинностью, и, следовательно, его можно использовать для очистки белка путем аффинная хроматография а также может использоваться для обнаружения белков в живых клетках. Он использовался для разделения рекомбинантный, сверхэкспрессированный белок из дикого типа белок, экспрессируемый организмом-хозяином. Его также можно использовать для изоляции белковые комплексы с несколькими субъединицами, потому что его мягкая процедура очистки не разрушает такие комплексы. Он был использован для получения белков достаточной чистоты и качества для определения трехмерной структуры с помощью рентгеновской кристаллографии.


ФЛАГ-тег можно использовать во многих анализы которые требуют признания антитело. Если нет антитела против данного белка, добавление тега FLAG к белку позволяет исследовать белок с помощью антитела против последовательности FLAG. Примерами являются исследования клеточной локализации, проведенные иммунофлуоресценция, иммунопреципитация или обнаружение СТРАНИЦА SDS электрофорез белков и вестерн-блоттинг.

Пептидная последовательность FLAG-метки от N-конца до C-конца: DYKDDDDK (1012 Да). Кроме того, его можно использовать в тандеме, обычно с пептидом 3xFLAG: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (с последней меткой, кодирующей сайт расщепления энтерокиназой). Он может быть слит с С-концом или N-концом белка или вставлен в белок. Некоторые коммерчески доступные антитела (например, M1 / ​​4E11) распознают эпитоп только когда он присутствует на N-конце. Однако другие доступные антитела (например, M2) нечувствительны к положению. Остаток тирозина во FLAG-теге может быть сульфатированный, которые могут влиять на распознавание антителом эпитопа FLAG.[3] Тег FLAG может использоваться вместе с другими тегами аффинити, например, тегом polyhistidine (Его тег ), HA-тег или же myc-tag.

История

Первое использование мечения эпитопа было описано Munro и Pelham в 1984 году.[4] Тег FLAG был вторым примером полностью функциональной, улучшенной метки эпитопа, опубликованным в научной литературе.[1][5][6] и был единственной запатентованной меткой эпитопа.[7][8] С тех пор он стал наиболее часто используемой белковой меткой в ​​лабораториях по всему миру. В отличие от некоторых других меток (например, myc, HA), где моноклональные антитела сначала выделяли против существующего белка, а затем эпитоп характеризовали и использовали в качестве метки, эпитоп FLAG представлял собой идеализированный искусственный дизайн, к которому были выведены моноклональные антитела. . Структура тега FLAG была оптимизирована для совместимости с белками, к которым он прикреплен, в том смысле, что он более гидрофильный, чем другие распространенные теги эпитопа, и, следовательно, с меньшей вероятностью денатурирует или инактивирует белки, к которым он присоединен. Кроме того, N-концевые теги FLAG можно легко удалить с белков после их выделения путем обработки специфической протеазой, энтерокиназой (энтеропептидаза ).

Третий отчет о маркировке эпитопа, (HA-тег ),[9] появилась примерно через год после первой поставки системы Flag.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Хопп Т.П., Прикетт К.С., Прайс В.Л., Либби Р.Т., Марч С.Дж., Пэт Черретти Д., Урдал Д.Л., Конлон П.Дж. (1988). «Короткая последовательность маркера полипептида, полезная для идентификации и очистки рекомбинантного белка». Био / Технологии. 6 (10): 1204–10. Дои:10.1038 / nbt1088-1204. S2CID  205272216.
  2. ^ «Куб Биотех». Куб Биотех. Получено 2020-02-13.
  3. ^ Хантер М.Р., Гримси Н.Л., Гласс М. (2016). «Сульфатирование эпитопа FLAG зависит от совместной экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, в модели клеток млекопитающих». Научные отчеты. 6: 27316. Bibcode:2016НатСР ... 627316H. Дои:10.1038 / srep27316. ЧВК  4895180. PMID  27273047.
  4. ^ Манро С., Пелхэм Х. Р. (1984). «Использование пептидной мечения для обнаружения белков, экспрессируемых из клонированных генов: делеционное картирование функциональных доменов Hsp 70 Drosophila». Журнал EMBO. 3 (13): 3087–93. Дои:10.1002 / j.1460-2075.1984.tb02263.x. ЧВК  557822. PMID  6526011.
  5. ^ Эйнхауэр А., Юнгбауэр А. (2001). «Пептид FLAG, универсальная гибридная метка для очистки рекомбинантных белков». Журнал биохимических и биофизических методов. 49 (1–3): 455–65. Дои:10.1016 / S0165-022X (01) 00213-5. PMID  11694294.
  6. ^ «Добавление эпитопа к последовательности, кодирующей белок: FLAG-тег». Логика молекулярных подходов к биологическим проблемам. Корнелл Университет.
  7. ^ FLAG - зарегистрированная торговая марка компании Sigma-Aldrich Co. LLC.
  8. ^ США предоставили 4703004, Hopp TP, "Синтез белка с идентификационным пептидом (векторами)", выпущенный в 1987 году, присвоенный Immunex Corp. 
  9. ^ Поле Дж., Никава Дж., Брук Д., Макдональд Б., Роджерс Л., Уилсон И.А., Лернер Р.А., Виглер М. (1988). «Очистка RAS-чувствительного комплекса аденилатциклазы из Saccharomyces cerevisiae с использованием метода добавления эпитопа». Молекулярная и клеточная биология. 8 (5): 2159–65. Дои:10.1128 / mcb.8.5.2159. ЧВК  363397. PMID  2455217.