Полигистидин-тег - Википедия - Polyhistidine-tag

Простой столбец для Ni2+-аффинная хроматография. Образец и последующие буферы вручную заливаются в колонку.

А полигистидин-тег является аминокислота мотив в белки обычно состоит как минимум из шести гистидин (Его) остатков, часто на N- или C-конце белка. Он также известен как гекса-гистидин-тег, 6xHis-тег, His6 тег, под торговой маркой США ЕГО ТЕГ (Серийный номер товарного знака США 74242707), и чаще всего как His-Tag. Тег был изобретен Рош,[1] хотя использование гистидинов и их векторов распределяется Qiagen. Различные наборы для очистки белков, меченных гистидином, доступны в Qiagen, Сигма, Thermo Scientific, GE Healthcare, Машери-Нагель, Куб Биотех, Клонтех, Био-Рад, [Bio-Works ] и другие.

Использование тега для академических пользователей не ограничивалось; однако коммерческие пользователи должны были платить роялти Рошу. Срок действия первоначального патента истек 11 февраля 2003 г., и теперь он является государственной собственностью; Текущие претензии по роялти основаны на гораздо более узком наборе более поздних патентов. Подходящие последовательности тегов доступны бесплатно для коммерческого использования; например, MK (HQ) 6 может использоваться для улучшенного выражения в Кишечная палочка и удаление тегов. Общее количество остатков гистидина может варьироваться в метке от двух до 10 или более остатков His. N- или C-концевые his-теги также могут сопровождаться или предшествовать, соответственно, подходящим аминокислотная последовательность что облегчает удаление полигистидинового тега с помощью эндопептидазы. В этой дополнительной последовательности нет необходимости, если экзопептидазы используются для удаления N-концевых His-тегов (например, Qiagen TAGZyme). Кроме того, расщепление экзопептидазой может решить неспецифическое расщепление, наблюдаемое при использовании удаления метки на основе эндопротеазы. Полигистидиновые метки часто используются для аффинная очистка из генетически модифицированный белки.

Принцип

Три вида рентгеновской структуры Ni (NTA) (H2O)2

В общем, белки обладают более или менее способностью координировать ионы металлов на своей поверхности, и можно разделить белки хроматографией, используя разницу в их сродстве. Это аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов, анонсированная в 1975 году.[2] Последующие исследования показали, что среди аминокислот, составляющих белки, гистидин сильно участвует в координационной связи с ионами металлов.[3] Следовательно, если с помощью генной инженерии к концу белка добавить несколько гистидинов, сродство белка к иону металла заметно возрастет, и основная идея состоит в том, что очистку можно легко провести. Когда белок, имеющий His-метку, приводится в контакт с носителем, на котором иммобилизован ион металла, например никель, в условиях pH 8 или выше, остаток гистидина хелатирует ион металла и связывается с носителем. Поскольку другие белки не связываются с носителем или связываются очень слабо, его можно удалить, промывая носитель подходящим буфером. После этого путем удаления имидазола или подобного из носителя можно выделить белок, имеющий His-метку, с высокой чистотой.

Практический выбор

Перевозчик

Различные перевозчики, такие как Ni - NTA агароза (никель - нитрилотриуксусная кислота) присутствуют на рынке. Он упакован в колонку и используется в сочетании с центрифугированием и магнитной сепарацией в пробирке.

Ионы металлов

Как ион металла, медь имеет самое высокое сродство, и сродство уменьшается в порядке убывания никеля, цинка и кобальта.[нужна цитата ]. Никель часто используется для обычных целей, а кобальт используется, когда желательно повысить чистоту очистки.

Метод элюирования

Для того, чтобы элюировать His-меченный белок с носителя, существует множество следующих методов, и он будет использоваться надлежащим образом в соответствии с назначением. Чтобы избежать денатурации белков, желательно иметь как можно более мягкий раствор, и с этой точки зрения часто используется добавление имидазола.

Конкуренция с аналогами

Когда соединение, имеющее структуру, подобную остатку гистидина, добавляется в высокой концентрации, белок конкурирует с координацией иона металла, так что белок отделяется от носителя. Имидазол представляет собой соединение, составляющее боковую цепь гистидина, и часто используется в концентрации 150 мМ или более. Кроме того, в некоторых случаях можно использовать гистидин и гистамин.

Снижение pH

Когда pH снижается, остаток гистидина протонируется и выходит из носителя, потому что ион металла не может быть скоординирован. Когда никель используется в качестве иона металла, его элюирование составляет около 4, а кобальта - около 6.

Удаление ионов металлов

Когда добавляется сильный хелатирующий агент, белок отделяется от носителя, потому что ион металла, иммобилизованный на носителе, теряется. Используется исключительно ЭДТА.

Приложения

Очистка белков

Полигистидиновые метки часто используются для аффинной очистки рекомбинантных белков, меченных полигистидином, экспрессируемых в кишечная палочка [4] и другие прокариотические системы экспрессии. Бактериальные клетки собираются через центрифугирование и полученный осадок клеток лизируется либо физическими средствами, либо с помощью детергентов и ферменты Такие как лизоцим или любое их сочетание. На этом этапе неочищенный лизат содержит рекомбинантный белок среди многих других белков, происходящих от бактериального хозяина. Эту смесь инкубируют с аффинной смолой, содержащей связанный двухвалентный никель или же кобальт ионы, которые коммерчески доступны в различных вариантах. Никель и кобальт обладают схожими свойствами и, поскольку они являются соседними переходными металлами периода 4 (v. железная триада ). Эти смолы обычно представляют собой сефарозу / агарозу, функционализированную хелатор, Такие как иминодиуксусная кислота (Ni-IDA) и нитрилотриуксусная кислота (Ni-NTA) для никеля и карбоксиметиласпартат (Co-CMA) для кобальта, которые полигистидиновая метка связывает с микромолярным сродством. Эрнст Хочули и др. связал в 1987 г. лиганд NTA и ионы никеля с агароза бусы.[5] Затем смолу промывают фосфатным буфером для удаления белков, которые специфически не взаимодействуют с ионами кобальта или никеля. При использовании методов на основе никеля эффективность промывки можно повысить добавлением 20 мМ имидазол (белки обычно элюируются 150-300 мМ имидазолом). Как правило, смолы на основе никеля обладают более высокой связывающей способностью, а смолы на основе кобальта обладают высочайшей чистотой. Чистоту и количество белка можно оценить по SDS-СТРАНИЦА и Вестерн-блоттинг.[нужна цитата ]

Аффинная очистка с использованием полигистидиновой метки обычно приводит к относительно чистому белку, когда рекомбинантный белок экспрессируется в прокариотических организмах. В зависимости от последующих применений, включая очистку белковых комплексов для изучения взаимодействия белков, очистку от высших организмов, таких как дрожжи или другой эукариоты может потребоваться тандемная аффинная очистка[6] использование двух тегов для получения более высокой чистоты. Альтернативно, одностадийная очистка с использованием иммобилизованных ионов кобальта, а не ионов никеля, обычно дает существенное повышение чистоты и требует более низких концентраций имидазола для элюирования гист-меченного белка.

Мечение полигистидином - это вариант выбора для очистки рекомбинантных белков в денатурирующих условиях, поскольку его способ действия зависит только от первичной структуры белков. Например, даже когда рекомбинантный белок принудительно экспрессируется в Кишечная палочка образует тельца включения и не может быть получен в виде растворимого белка, его можно очистить денатурацией мочевиной или гидрохлоридом гуанидина. Обычно для такого рода методов связывание гистидина титруют с использованием pH вместо связывания имидазола - при высоком pH гистидин связывается с никелем или кобальтом, но при низком pH (~ 6 для кобальта и ~ 4 для никеля) гистидин становится протонированным. и конкурирует с ионом металла. Сравните это с очисткой антител и Очистка GST, предварительным условием для которого является правильная (нативная) укладка белков. С другой стороны, говорят, что тег His имеет тенденцию к агрегированию и превращению в нерастворимую больше, чем другие теги сродства.

Колонки с полигистидиновой меткой задерживают несколько хорошо известных белков в качестве примесей. Одним из них является пептидилпролилизомераза FKBP-типа, которая появляется около 25 кДа (SlyD). Примеси обычно удаляются с использованием вторичной хроматографии или путем экспрессии рекомбинантного белка в SlyD-дефицитном Кишечная палочка напряжение.[7] В качестве альтернативы, по сравнению со смолами на основе никеля, смолы на основе кобальта имеют меньшее сродство с SlyD от Кишечная палочка, но в некоторых случаях это умеренно полезно.[8]

Отделение одного от двух полигистидиновых тегов

Белки с разным количеством полигистидиновых меток элюируются по-разному из никелево-аффинной смолы. Для белков с одной гексагистидиновой меткой 75 мМ имидазола позволяет элюировать из Ni-NTA, тогда как для белков с двумя гексагистидиновыми метками для элюирования требуется 100 мМ имидазол.[нужна цитата ] Это ступенчатое элюирование можно использовать для выделения специфических белковых ансамблей из смеси, таких как определенные гетеромультимеры (например, гетеродимер AB из смеси, включающей гомодимеры AA и BB, если только субъединица B имеет полигистидиновую метку). Такой подход был использован при выделении одновалентных стрептавидин.[9]

Анализы связывания

Мечение полигистидином может быть использовано для обнаружения белок-белковых взаимодействий таким же образом, как и тянуть вниз проба. Однако этот метод обычно считается менее чувствительным, а также ограничен некоторыми из более привередливых аспектов этого метода. Например, нельзя использовать восстанавливающие условия, EDTA и нельзя использовать многие типы моющих средств. Последние достижения в двойная поляризационная интерферометрия поддается ЭДТА и более широкому использованию реагентов, а использование таких специфичных для сайта тегов значительно упрощает прямое измерение связанных конформационное изменение.[нужна цитата ]

Флуоресцентные метки

Также были разработаны метки Hexahistadine CyDye. В них используется ковалентная координация никеля с группами ЭДТА, присоединенными к флуорофорам, для создания красителей, которые присоединяются к полигистидиновой метке. Было показано, что этот метод эффективен для отслеживания миграции и транспортировки белков. Также были недавние открытия, показывающие, что этот метод может быть эффективным для измерения расстояния с помощью флуоресцентной резонансной передачи энергии.[10]

Фторгистидиновые метки

Сообщалось о полифторгистидиновой метке для использования в in vitro системы перевода.[11] В этой системе расширенный генетический код используется, в котором гистидин заменен 4-фторгистидином. Фторированный аналог включается в пептиды через ослабленную субстратную специфичность гистидин-тРНК лигаза и снижает общий pKа тега. Это дает возможность селективного обогащения пептидов, меченных полифторгистидином, в присутствии сложных смесей традиционных полигистидиновых меток путем изменения pH промывочных буферов.

Добавление полигистидиновых тегов

Добавление полигистидиновых тегов. (A) His-метка добавляется путем вставки ДНК, кодирующей интересующий белок, в вектор, который имеет метку, готовую к слиянию на С-конце. (B) His-метка добавляется с использованием праймеров, содержащих метку, после реакции ПЦР метка сливается с N-концом гена.

Наиболее распространенные полигистидиновые метки состоят из шести остатков гистидина (6xHis-метка), которые добавляются в N-конец предшествует Метионин или же C-конец перед стоп-кодоном, в кодирующей последовательности белок представляет интерес. Выбор конца, на котором добавляется His-метка, будет зависеть в основном от характеристик белка и методов, выбранных для удаления метки. Некоторые концы скрыты внутри ядра белка, а другие важны для функции или структуры белка. В таких случаях выбор ограничивается другим концом. С другой стороны, наиболее доступные экзопептидазы может только удалить His-тег с N-конца; удаление тега с C-конца потребует использования других методов. Важно учитывать, что компьютерное моделирование (с помощью молекулярной динамики) поможет вам выбрать один из вариантов, например, нужно ли переваривать His-тег или создавать его на N- или C-конце.[12]

Есть два способа добавить полигистидины. Самый простой - вставить ДНК, кодирующую белок, в вектор, кодирующий His-метку, так, чтобы она автоматически прикреплялась к одному из его концов. (См. Картинку). Другой метод - выполнить ПЦР с грунтовки которые имеют повторяющийся гистидин кодоны (CAT или CAC) рядом с НАЧНИТЕ или же СТОП-кодон в дополнение к нескольким (16 или более) основаниям с одного конца ДНК, кодирующим белок, который нужно пометить (см. пример праймера ниже).[нужна цитата ]

His-tag-primers.png

Пример праймера, предназначенного для добавления 6xHis-метки с помощью ПЦР. Восемнадцать оснований, кодирующих шесть гистидинов, вставляются сразу после кодона START или прямо перед кодоном STOP. Рядом с His-тегом необходимо не менее 16 оснований, специфичных для интересующего гена. С 6 His белок будет иметь добавленную молекулярную массу 1 кДа. Часто линкер (такой как гли-гли-гли или гли-сер-гли) помещается между представляющим интерес белком и меткой 6 His, чтобы предотвратить влияние полигистидиновой метки на активность меченного белка.[нужна цитата ]

Обнаружение

Полигистидиновый тег также может быть использован для обнаружения белка с помощью анти-полигистидинового тега. антитела или, альтернативно, окрашиванием в геле (SDS-СТРАНИЦА ) с флуоресцентными зондами, несущими ионы металлов. Это может быть полезно в субклеточная локализация, ELISA, вестерн-блоттинг или другие иммуноаналитические методы.[нужна цитата ]

Иммобилизация

Полигистидиновый тег можно успешно использовать для иммобилизации белков на поверхности, например, на покрытой никелем или кобальтом поверхности. микротитровальный планшет или на белковый массив.[13]

Похожие теги

Тег HQ

Тег HQ содержит чередующиеся гистидин и глутамин (HQHQHQ).

Тег HN

Метка HN содержит чередующиеся гистидин и аспарагин (HNHNHNHNHNHN) и с большей вероятностью будет представлена ​​на поверхности белка, чем метки, содержащие только гистидин. Метка HN связывается с иммобилизованным ионом металла более эффективно, чем метка His.[14]

Тег HAT

Тег HAT представляет собой пептидную метку (KDHLIHNVHKEEHAHAHNK), полученную из куриного лактатдегидрогеназа, и более вероятно, что это будет растворимый белок без смещения в распределении заряда по сравнению с His-меткой.[15] Расположение гистидинов в теге HAT обеспечивает высокую доступность по сравнению с тегом His, и он эффективно связывается с иммобилизованным ионом металла.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Hochuli, E .; Bannwarth, W .; Döbeli, H .; Gentz, R .; Штюбер, Д. (1988). «Генетический подход к облегчению очистки рекомбинантных белков с новым металлохелатным адсорбентом». Био / Технологии. 6 (11): 1321–5. Дои:10.1038 / nbt1188-1321. S2CID  9518666. ИНИСТ:7229670.
  2. ^ Porath, J .; и другие. (1975). «Металлохелатная аффинная хроматография, новый подход к фракционированию белков». Природа. 258 (5536): 598–599. Bibcode:1975Натура.258..598P. Дои:10.1038 / 258598a0. PMID  1678. S2CID  4271836.
  3. ^ Порат, Дж. (1992). «Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов». Protein Expr. Purif. 3 (4): 263–281. Дои:10.1016 / 1046-5928 (92) 90001-Д. PMID  1422221.
  4. ^ Хенген, Пол Н (1995). «Очистка слитых белков His-Tag из Escherichia coli». Тенденции в биохимических науках. 20 (7): 285–6. Дои:10.1016 / S0968-0004 (00) 89045-3. PMID  7667882.
  5. ^ Hochuli, E .; Döbeli, H .; Шахер, А. (январь 1987 г.). «Новый металлохелатный адсорбент, селективный в отношении белков и пептидов, содержащих соседние остатки гистидина». Журнал хроматографии А. 411: 177–184. Дои:10.1016 / s0021-9673 (00) 93969-4. ISSN  0021-9673. PMID  3443622.
  6. ^ Гэвин, Анн-Клод; Бёше, Маркус; Краузе, Роланд; Гранди, Паола; Марциох, Мартина; Бауэр, Андреас; Шульц, Йорг; Рик, Дженс М .; Мишон, Анн-Мари; Круциат, Кристина-Мария; Раскаяние, Марита; Хёферт, Кристиан; Шельдер, Малгожата; Браженович, Миро; Раффнер, Хайнц; Мерино, Алехандро; Кляйн, Карин; Худак, Мануэла; Диксон, Дэвид; Руди, Татьяна; Гнау, Фолькер; Баух, Анджела; Бастак, Соня; Хухсе, Беттина; Лейтвейн, Кристина; Эртье, Мари-Анн; Копли, Ричард Р .; Эдельманн, Анджела; Querfurth, Эрих; и другие. (2002). «Функциональная организация протеома дрожжей путем систематического анализа белковых комплексов». Природа. 415 (6868): 141–7. Bibcode:2002Натура.415..141Г. Дои:10.1038 / 415141a. PMID  11805826. S2CID  4425555.
  7. ^ Андерсен, Каспер Р .; Лекса, Нина Ц .; Шварц, Томас У. (2013). "Оптимизировано Кишечная палочка экспрессионный штамм LOBSTR удаляет обычные загрязнители из очистки His-tag » (PDF). Белки: структура, функции и биоинформатика. 81 (11): 1857–61. Дои:10.1002 / prot.24364. ЧВК  4086167. PMID  23852738.
  8. ^ Чен, Сюгуан; Номани, Алиреза; Патель, Никет; Хатефи, Араш (2017). «Производство низкоэкспрессируемых рекомбинантных катионных биополимеров высокой чистоты». Экспрессия и очистка белков. 134: 11–17. Дои:10.1016 / j.pep.2017.03.012. ЧВК  5479735. PMID  28315745.
  9. ^ Ховарт, Марк; Chinnapen, Daniel J-F; Герроу, Кимберли; Доррестейн, Питер С.; Гранди, Мелани Р.; Kelleher, Neil L; Эль-Хусейни, штат Алабама; Тинг, Алиса Y (2006). «Моновалентный стрептавидин с одним фемтомолярным сайтом связывания биотина». Методы природы. 3 (4): 267–73. Дои:10.1038 / nmeth861. ЧВК  2576293. PMID  16554831.
  10. ^ Чжао, Чунься; Хеллман, Лэнс М .; Чжань, Синь; Bowman, Willis S .; Уайтхарт, Сидни У .; Фрид, Майкл Г. (2010). «Оптические зонды, специфичные для гексагистидиновой метки, для анализа белков и их взаимодействий». Аналитическая биохимия. 399 (2): 237–45. Дои:10.1016 / j.ab.2009.12.028. ЧВК  2832190. PMID  20036207.
  11. ^ Кольцо Кристин М .; Икбал, Эмиль С .; Хакер, Дэвид Э .; Хартман, Мэтью С. Т .; Кропп, Т. Эштон (31 мая 2017 г.). «Генетическое включение 4-фторгистидина в пептиды обеспечивает селективную аффинную очистку». Органическая и биомолекулярная химия. 15 (21): 4536–4539. Дои:10.1039 / C7OB00844A. ISSN  1477-0539. ЧВК  6010304. PMID  28517015.
  12. ^ Мендоса-Ллеренас, Эдгар Омар; Перес, Дэвид Хавьер; Гомес-Сандовал, Зеферино; Эскаланте-Минаката, Пилар; Ибарра-Джункера, Врани; Разо-Эрнандес, Родриго Саид; Капоцци, Витторио; Руссо, Паскуале; Спано, Джузеппе; Fiocco, Daniela; Осуна-Кастро, Хуан Альберто; Морено, Абель (2016). «Lactobacillus plantarum WCFS1 β-Fructosidase: доказательство наличия открытого воронкообразного канала через каталитический домен с важностью для селективности субстрата». Прикладная биохимия и биотехнология. 180 (6): 1056–1075. Дои:10.1007 / s12010-016-2152-2. PMID  27295039. S2CID  43120601.
  13. ^ Лю, И-Чи Ц; Рибен, Натали; Иверсен, Ларс; Соренсен, Брайан С; Пак, Дживун; Нюгард, Джеспер; Мартинес, Карен Л. (18 июня 2010 г.). «Специфическая и обратимая иммобилизация белков, меченных гистидином, на функционализированных кремниевых нанопроводах». Нанотехнологии. 21 (24): 245105. Bibcode:2010Нанот..21х5105Л. Дои:10.1088/0957-4484/21/24/245105. PMID  20498527.
  14. ^ Патент США 7,176,298
  15. ^ Чага, Григорий; Бочкарев, Дмитрий Е .; Джохадзе, Георгий Г .; Хопп, Дженнифер; Нельсон, Пол (1999). «Природная аффинная метка поли-гистидина для очистки рекомбинантных белков на агарозе, сшитой кобальт (II) -карбоксиметиласпартатом». Журнал хроматографии А. 864 (2): 247–256. Дои:10.1016 / S0021-9673 (99) 01008-0. PMID  10669292.

внешняя ссылка