Анализ кривой плавления - Melting curve analysis

Анализ кривой плавления представляет собой оценку характеристик диссоциации двухцепочечных ДНК во время нагрева. При повышении температуры двойная нить начинает диссоциировать, что приводит к увеличению интенсивности поглощения, гиперхромность. Температура, при которой денатурируется 50% ДНК, известна как температура плавления.

Собранная информация может быть использована для определения присутствия и личности однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). Это потому, что пары оснований G-C имеют 3 водородные связи между ними, в то время как пары оснований AT имеют только 2. ДНК с более высоким содержанием GC, будь то из-за ее источника (содержание GC: E. coli 0.50, M. luteus 0.72, poly d (AT) 0.00) или, как упоминалось ранее, потому что SNP будет иметь более высокую температуру плавления, чем ДНК с более высоким содержанием AT.

Информация также дает важные подсказки о способе взаимодействия молекулы с ДНК. Молекулы, такие как интеркаляторы слот между парами оснований и взаимодействовать через пи стекинг. Это оказывает стабилизирующее действие на структуру ДНК, что приводит к повышению температуры ее плавления. Точно так же увеличение концентрации соли помогает рассеять отрицательное отталкивание между фосфатами в основной цепи ДНК. Это также приводит к повышению температуры плавления ДНК. И наоборот, pH может отрицательно влиять на стабильность ДНК, что может привести к снижению температуры ее плавления.

Выполнение

Графики, показывающие взаимосвязь между флуоресценцией и температурой для меченого зонда, разработанного для последовательности Wt, гомозиготных ситуаций Wt, гетерозиготных и гомозиготных мутантов

Энергия, необходимая для разрыва водородной связи основание-основание между двумя цепями ДНК, зависит от их длины, содержания GC и их комплементарности. Эти свойства можно вывести путем нагревания реакционной смеси, содержащей последовательности двухцепочечной ДНК, и измерения диссоциации в зависимости от температуры.

Первоначально диссоциацию нити наблюдали с помощью измерений УФ-поглощения,[1] но методы, основанные на измерениях флуоресценции[2] сейчас самый распространенный подход.

Зависимую от температуры диссоциацию между двумя нитями ДНК можно измерить с помощью ДНК-интеркаляция флуорофор Такие как SYBR зеленый, EvaGreen или с флуорофором ДНК-зонды. В случае зеленого SYBR (который флуоресцирует в 1000 раз более интенсивно при интеркалировании в малую бороздку двух цепей ДНК), диссоциацию ДНК во время нагревания можно измерить по значительному уменьшению флуоресценции, которое в результате получается.[3] В качестве альтернативы, расположенные рядом зонды (один с флуорофором, а другой с подходящим тушитель ) можно использовать для определения комплементарности зонда целевой последовательности.[3]

График негатива первая производная кривой плавления может облегчить определение температуры диссоциации (определяемой как диссоциация 50%) благодаря пикам, образованным таким образом.

SYBR Green позволил дифференцировать продукт в LightCycler в 1997 году.[4] Было также продемонстрировано, что гибридизационные зонды (или зонды FRET) обеспечивают очень специфические кривые плавления одноцепочечного (ss) гибрида зонда с ампликоном. Idaho Technology и Roche много сделали для популяризации этого использования прибора LightCycler.

Приложения

С конца 1990-х годов анализ продуктов с помощью SYBR Green, других двухцепочечных специфических красителей или анализ кривой плавления на основе зонда стал почти повсеместным. Метод на основе зондов достаточно чувствителен для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и может различать гомозиготный дикого типа, гетерозиготный и гомозиготный мутант аллели в силу полученных паттернов диссоциации. Без зондов плавление ампликона (плавление и анализ всего продукта ПЦР), как правило, не позволяло найти варианты с одним основанием по профилям плавления. Благодаря приборам с более высоким разрешением и усовершенствованным красителям анализ плавления ампликонов одного варианта основания теперь возможен с помощью нескольких имеющихся в продаже приборов. Например: Applied Biosystems 7500 Fast System и 7900HT Fast Real-Time PCR System, LightScanner Idaho Technology (первое плавильное устройство высокого разрешения на основе планшетов), инструменты Qiagen Rotor-Gene и Roche LightCycler 480.

Множество исследований и клинических примеров[5] В литературе существуют примеры использования анализа кривой плавления, чтобы избежать или дополнить усилия по секвенированию и, таким образом, снизить затраты.

Хотя большинство количественная ПЦР машины имеют возможность построения и анализа кривых плавления, уровень анализа и программного обеспечения варьируется. Расплав высокого разрешения (известное как Hi-Res плавление или HRM) является развитием этой общей технологии и предлагает более высокую чувствительность для обнаружения SNP в пределах всего окрашенного красителем ампликона. Менее затратно и проще по конструкции разрабатывать системы кривых плавления без датчиков. Однако для приложений генотипирования, где необходимо обрабатывать большие объемы образцов, стоимость разработки может быть менее важной, чем общая производительность и простота интерпретации, поэтому предпочтение отдается методам генотипирования на основе зондов.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Ансевин, А.Т .; Vizard, D.L .; Brown, B.W .; МакКонати, Дж. (1976), "Тепловая денатурация ДНК с высоким разрешением. I. Теоретические и практические соображения по разрешению термических субпереходов", Биополимеры, 15 (1): 153–74, Дои:10.1002 / bip.1976.360150111, PMID  1244898
  2. ^ Ririe, K.M .; Rasmussen, R.P .; Виттвер, К. (1997), "Дифференциация продуктов путем анализа кривых плавления ДНК во время полимеразной цепной реакции", Анальный. Biochem., 245 (2): 154–60, Дои:10.1006 / abio.1996.9916, PMID  9056205
  3. ^ а б Хоу, Шоу (2010). Биокатализ и биомолекулярная инженерия. Джон Вили и сыновья. С. 314–317.
  4. ^ Рири, 1997
  5. ^ Lay MJ, Wittwer CT. (1997) Флуоресцентное генотипирование фактора V Лейдена в реальном времени во время быстрой ПЦР. Clin Chem. 1997 декабрь; 43 (12): 2262-7
  6. ^ Винкен CJ, Baaske P, Duhr S, Braun D (2011), «Кривые термофоретического плавления позволяют количественно оценить конформацию и стабильность РНК и ДНК», Исследования нуклеиновых кислот, 39 (8): e52 – e52, Дои:10.1093 / nar / gkr035, ЧВК  3082908, PMID  21297115.

внешняя ссылка

  • Рири, км; Расмуссен, RP; Виттвер, Коннектикут (1997). «Дифференциация продуктов путем анализа кривых плавления ДНК в ходе полимеразной цепной реакции». Анальный биохим. 245 (2): 154–160. Дои:10.1006 / abio.1996.9916. PMID  9056205.
  • Ло, Патчик К. Х. (2014-10-21). «Моменты: анализ кривой плавления». Биотехнологии. Получено 2014-10-21.