Флуорофор - Википедия - Fluorophore

Для использования и теории флуоресценции см. Флуоресценция в науках о жизни.
Меченный флуорофором человеческая клетка.

А флуорофор (или же флуорохром, аналогично хромофор ) это флуоресцентный химическое соединение которые могут повторно излучать свет при возбуждении светом. Флуорофоры обычно содержат несколько комбинированных ароматный группы, плоские или циклические молекулы с несколькими π связи.[1]

Иногда флуорофоры используются отдельно, как трассирующий в жидкостях, как краситель за окрашивание определенных структур, как подложка ферменты или в качестве зонда или индикатора (когда на его флуоресценцию влияют факторы окружающей среды, такие как полярность или ионы). В более общем плане они ковалентно связанный к макромолекула, служащий маркером (или красителем, или меткой, или репортером) для аффинных или биоактивных реагентов (антитела, пептиды, нуклеиновые кислоты). Флуорофоры, в частности, используются для окрашивания тканей, клеток или материалов в различных аналитических методах, т. Е. флуоресцентная визуализация и спектроскопия.

Флуоресцеин через его амино-реактивное изотиоцианатное производное флуоресцеина изотиоцианат (FITC), был одним из самых популярных флуорофоров. Начиная с маркировки антител, приложения распространились на нуклеиновые кислоты благодаря карбоксифлуоресцеин (FAM), TET, ...). Другие исторически распространенные флуорофоры являются производными родамин (TRITC), кумарин, и цианин.[2] Новые поколения флуорофоров, многие из которых являются запатентованными, часто работают лучше, будучи более фотостабильными, яркими и / или менее яркими. pH -чувствительны, чем традиционные красители, с сопоставимым возбуждением и излучением.[3][4]

Флуоресценция

Флуорофор поглощает световую энергию определенной длины волны и повторно излучает свет с большей длиной волны. Поглощенный длины волн, эффективность передачи энергии, и время до излучения зависят как от структуры флуорофора, так и от его химического окружения, поскольку молекула в возбужденном состоянии взаимодействует с окружающими молекулами. Длины волн максимального поглощения (≈ возбуждения) и излучения (например, поглощение / излучение = 485 нм / 517 нм) являются типичными терминами, используемыми для обозначения данного флуорофора, но весь спектр может быть важным для рассмотрения. Спектр длин волн возбуждения может быть очень узким или более широким диапазоном, или он может полностью выходить за пределы уровня отсечки. Спектр излучения обычно более резкий, чем спектр возбуждения, и он имеет более длинную волну и, соответственно, меньшую энергию. Диапазон энергий возбуждения от ультрафиолетовый сквозь видимый спектр, а энергии излучения могут продолжаться от видимый свет в ближний инфракрасный область, край.

Основные характеристики флуорофоров:

  • Максимальная длина волны возбуждения и излучения (выражено в нанометры (нм)): соответствует пику в спектрах возбуждения и испускания (обычно по одному пику).
  • Молярный коэффициент поглощения (в молярных−1см−1): связывает количество поглощенного света на данной длине волны с концентрацией флуорофора в растворе.
  • Квантовый выход: эффективность энергии, передаваемой от падающего света к испускаемой флуоресценции (= количество испускаемых фотонов на поглощенные фотоны).
  • Продолжительность жизни (в пикосекундах): продолжительность возбужденного состояния флуорофора перед возвращением в основное состояние. Это время, необходимое для того, чтобы популяция возбужденных флуорофоров распалась до 1 / e (≈0,368) от исходного количества.
  • Стоксов сдвиг: разница между максимальной длиной волны возбуждения и максимальной длиной волны излучения.
  • Темная фракция: доля молекул, активных в испускании флуоресценции. За квантовые точки Длительная микроскопия одиночных молекул показала, что 20-90% всех частиц никогда не излучают флуоресценции.[5] С другой стороны, наночастицы конъюгированного полимера (Pdots) почти не показывают темной фракции в своей флуоресценции.[6] Флуоресцентные белки может иметь темную фракцию из-за неправильной упаковки белка или образования дефектных хромофоров.[7]

Эти характеристики определяют другие свойства, включая фотообесцвечивание или фоторезистентность (потеря флуоресценции при непрерывном возбуждении светом). Следует учитывать и другие параметры, например полярность молекулы флуорофора, размер и форму флуорофора (т.е. поляризационная флуоресценция паттерн), и другие факторы могут изменить поведение флуорофоров.

Флуорофоры также можно использовать для тушения флуоресценции других флуоресцентных красителей (см. Статью Тушение (флуоресценция) ) или передавать их флуоресценцию на еще более длинных волнах (см. статью Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)).

Смотрите больше на принцип флуоресценции.

Размер (молекулярная масса)

Большинство флуорофоров являются органическими маленькие молекулы 20 - 100 атомов (200 - 1000 Далтон - в молекулярный вес может быть выше в зависимости от привитых модификаций и конъюгированных молекул), но есть также гораздо более крупные природные флуорофоры, которые белки: зеленый флуоресцентный белок (GFP) составляет 27 тыс.Да и несколько фикобилипротеины (PE, APC ...) ≈240 тыс.Да.

Частицы флуоресценции, такие как квантовые точки: Диаметр 2-10 нм, 100-100 000 атомов, также считаются флуорофорами.[8]

Размер флуорофора может стерически препятствуют меченной молекуле и влияют на полярность флуоресценции.

Семьи

Флуоресценция различных веществ в УФ-свете. Зеленый - флуоресцеин, красный - родамин B, желтый - родамин 6G, синий - хинин, фиолетовый - смесь хинина и родамина 6g. Растворы имеют концентрацию около 0,001% в воде.

Молекулы флуорофоров можно использовать по отдельности или в качестве флуоресцентного мотива функциональной системы. Основываясь на молекулярной сложности и методах синтеза, молекулы флуорофоров можно в целом разделить на четыре категории: белки и пептиды, небольшие органические соединения, синтетические олигомеры и полимеры и многокомпонентные системы.[9][10]

Флуоресцентные белки GFP (зеленый), YFP (желтый) и RFP (красный) могут быть присоединены к другим специфическим белкам для образования гибридный белок, синтезируется в клетках после трансфекции подходящего плазмида перевозчик.

Небелковые Органические флуорофоры принадлежат к следующим основным химическим семействам:

Эти флуорофоры флуоресцируют из-за делокализованных электронов, которые могут перескакивать через полосу и стабилизировать поглощенную энергию. Бензол, например, один из простейших ароматических углеводородов возбуждается на длине волны 254 нм и излучает на длине волны 300 нм.[11] Это отличает флуорофоры от квантовых точек, которые являются флуоресцентными полупроводниками. наночастицы.

Они могут быть присоединены к белку к определенным функциональным группам, таким как - амино- группы (активный эфир, карбоксилат, изотиоцианат, гидразин ), карбоксил группы (карбодиимид ), тиол (малеимид, ацетилбромид ), азид (через щелкните по химии или не специально (глутаральдегид )).

Кроме того, могут присутствовать различные функциональные группы для изменения его свойств, таких как растворимость, или придания особых свойств, таких как бороновая кислота который связывается с сахарами или несколькими карбоксильные группы связываться с определенными катионами. Когда краситель содержит электронодонорную и электроноакцепторную группы на противоположных концах ароматической системы, этот краситель, вероятно, будет чувствителен к полярности окружающей среды (сольватохромный ), поэтому называется чувствительным к окружающей среде. Часто красители используются внутри клеток, которые непроницаемы для заряженных молекул, в результате чего карбоксильные группы превращаются в сложный эфир, который удаляется эстеразами внутри клеток, например, фура-2АМ и флуоресцеиндиацетат.

Следующие семейства красителей: группы товарных знаков, и не обязательно имеют структурное сходство.

Ядра эндотелиальных клеток легочной артерии крупного рогатого скота, окрашенные в синий цвет DAPI, митохондрии окрашены в красный цвет с помощью MitoTracker Red CMXRos, и F-актин окрашенный в зеленый цвет с помощью Alexa Fluor 488 фаллоидин и отображены на флуоресцентном микроскопе.

Примеры часто встречающихся флуорофоров

Реактивные и конъюгированные красители

КрасительEx (нм)Em (нм)МВтПримечания
Гидроксикумарин325386331Сукцинимидиловый эфир
Аминокумарин350445330Сукцинимидиловый эфир
Метоксикумарин360410317Сукцинимидиловый эфир
Каскад Синий(375);401423596Гидразид
Тихоокеанский синий403455406Малеимид
Тихоокеанский апельсин403551
Люцифер желтый425528
NBD466539294NBD-X
R-фикоэритрин (PE)480;565578240 тыс.
Конъюгаты PE-Cy5480;565;650670он же Cychrome, R670, трехцветный, квантовый красный
Конъюгаты PE-Cy7480;565;743767
Красный 613480;565613PE-Texas Red
PerCP49067535 кДаБелок перидинин хлорофилл
TruRed490,675695Конъюгат PerCP-Cy5.5
FluorX494520587(GE Healthcare)
Флуоресцеин495519389FITC; чувствительный к pH
БОДИПИ-ФЛ503512
G-Dye100498524подходит для мечения белков и электрофореза
G-Dye200554575подходит для мечения белков и электрофореза
G-Dye300648663подходит для мечения белков и электрофореза
G-Dye400736760подходит для мечения белков и электрофореза
Cy2489506714QY 0,12
Cy3(512);550570;(615)767QY 0,15
Cy3B558572;(620)658QY 0,67
Cy3.5581594;(640)1102QY 0,15
Cy5(625);650670792QY 0,28
Cy5.56756941272QY 0,23
Cy7743767818QY 0,28
TRITC547572444TRITC
X-родамин570576548XRITC
Лиссамин Родамин B570590
Техасский красный589615625Сульфонилхлорид
Аллофикоцианин (APC)650660104 тыс.
Конъюгаты APC-Cy7650;755767Дальний красный

Сокращения:

Красители нуклеиновые кислоты

КрасительEx (нм)Em (нм)МВтПримечания
Hoechst 33342343483616AT-селективный
DAPI345455AT-селективный
Hoechst 33258345478624AT-селективный
SYTOX Синий431480~400ДНК
Хромомицин A3445575CG-селективный
Митрамицин445575
ЙОЙО-14915091271
Этидиум бромид210;285605394в водном растворе
Акридиновый апельсин503530/640ДНК / РНК
SYTOX Зеленый504523~600ДНК
ТОТО-1, ТО-ПРО-1509533Жизненно важное пятно, ТОТО: димер цианина
TO-PRO: цианиновый мономер
Тиазоловый апельсин510530
CyTRAK Оранжевый520615-(Биостатус) (красный возбуждение темный)
Пропидий Йодид (ИП)536617668.4
LDS 751543;590712;607472ДНК (543ex / 712em), РНК (590ex / 607em)
7-AAD5466477-аминоактиномицин D, CG-селективный
SYTOX апельсин547570~500ДНК
ТОТО-3, ТО-ПРО-3642661
DRAQ5600/647697413(Биостатус) (полезное возбуждение до 488)
DRAQ7599/644694~700(Биостатус) (полезное возбуждение до 488)

Красители функции клеток

КрасительEx (нм)Em (нм)МВтПримечания
Индо-1361/330490/4051010AM сложный эфир с низким / высоким содержанием кальция (Ca2+)
Флуо-3506526855AM сложный эфир. pH> 6
Флуо-4491/4945161097AM сложный эфир. pH 7,2
DCFH5055355292'7'Дихородигидрофлуоресцеин, окисленная форма
DHR505534346Дигидрородамин 123, окисленная форма, свет катализирует окисление
SNARF548/579587/635pH 6/9

Флуоресцентные белки

КрасительEx (нм)Em (нм)МВтQYBRPSПримечания
GFP (мутация Y66H)360442
GFP (мутация Y66F)360508
EBFP3804400.180.27мономер
EBFP238344820мономер
Азурит38344715мономер
GFPuv385508
Т-Сапфир3995110.602625слабый димер
Cerulean4334750.622736слабый димер
mCFP4334750.401364мономер
мБирюзовый24344740.9328мономер
ECFP4344770.153
CyPet4354770.511859слабый димер
GFP (мутация Y66W)436485
mKeima-Red4406200.243мономер (MBL)
TagCFP45848029димер (Евроген)
AmCyan14584890.7529тетрамер (Clontech)
mTFP146249254димер
GFP (мутация S65A)471504
Мидорииси Циан4724950.925димер (МБЛ)
GFP дикого типа396,47550826k0.77
GFP (мутация S65C)479507
TurboGFP48250226 тыс.0.5337димер, (Евроген)
Тег: GFP48250534мономер (Евроген)
GFP (мутация S65L)484510
Изумруд4875090.68390.69слабый димер (Invitrogen)
GFP (мутация S65T)488511
EGFP48850726k0.6034174слабый димер (Clontech)
Адзами Грин4925050.7441мономер (MBL)
ZsGreen1493505105 тыс.0.9140тетрамер (Clontech)
TagYFP50852447мономер (Евроген)
EYFP51452726k0.615160слабый димер (Clontech)
Топаз51452757мономер
Венера5155280.575315слабый димер
mCitrine5165290.765949мономер
YPet5175300.778049слабый димер
TurboYFP52553826 тыс.0.5355.7димер, (Евроген)
ZsЖелтый15295390.6513тетрамер (Clontech)
Кусабира Апельсин5485590.6031мономер (MBL)
mOrange5485620.69499мономер
Аллофикоцианин (БТР)652657.5105 кДа0.68гетеродимер, сшитый[12]
mKO5485590.6031122мономер
TurboRFP55357426 тыс.0.6762димер, (Евроген)
tdTomato5545810.699598тандемный димер
TagRFP55558450мономер (Евроген)
DsRed мономер556586~ 28 тыс.0.13.516мономер, (Clontech)
DsRed2 («RFP»)563582~ 110 тыс.0.5524(Клонтех)
мКлубника5745960.292615мономер
TurboFP60257460226 тыс.0.3526димер, (Евроген)
AsRed2576592~ 110 тыс.0.2113тетрамер (Clontech)
mRFP1584607~ 30 тыс.0.25мономер, (Цзянь лаборатория )
J-красный5846100.208.813димер
R-фикоэритрин (RPE)565 >498573250 кДа0.84гетеротример[12]
B-фикоэритрин (BPE)545572240 кДа0.98гетеротример[12]
мЧерри5876100.221696мономер
HcRed1588618~ 52 тыс.0.030.6димер (Clontech)
Катюша58863523димер
P3614662~ 10 000 кДафикобилисома сложный[12]
Перидинин хлорофилл (PerCP)48367635 кДатример[12]
mKate (TagFP635)58863515мономер (Евроген)
TurboFP63558863526 тыс.0.3422димер, (Евроген)
mPlum59064951,4 тыс.0.104.153
малина5986250.1513мономер, более быстрый фотоотбеливатель, чем mPlum

Сокращения:

Приложения

Дальнейшая информация: Флуоресценция в науках о жизни

Флуорофоры имеют особое значение в области биохимия и белок исследования, например, в иммунофлуоресценция но также и в клеточном анализе,[13] например иммуногистохимия[3][14] и сенсоры малых молекул.[15][16]

Использование вне наук о жизни

Кроме того, флуоресцентные красители находят широкое применение в промышленности под названием «неоновые цвета», такие как:

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Хуан Карлос Штокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). «Глава 3 Красители и флюорохромы». Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни. Издательство Bentham Science. С. 61–95. ISBN  978-1-68108-519-7. Получено 24 декабря 2017.
  2. ^ Ритдорф Дж (2005). Микроскопические методы. Достижения в области биохимической инженерии / биотехнологии. Берлин: Springer. С. 246–9. ISBN  3-540-23698-8. Получено 2008-12-13.
  3. ^ а б Цзянь Р.Ю .; Ваггонер А (1995). «Флуорофоры для конфокальной микроскопии». В Pawley JB (ред.). Справочник по биологической конфокальной микроскопии. Нью-Йорк: Пленум Пресс. С. 267–74. ISBN  0-306-44826-2. Получено 2008-12-13.
  4. ^ Лакович, младший (2006). Принципы флуоресцентной спектроскопии (3-е изд.). Springer. п. 954. ISBN  978-0-387-31278-1.
  5. ^ Понс Т., Мединц И.Л., Фаррелл Д., Ван X, Граймс А.Ф., Английский Д.С., Берти Л., Маттусси Х. (2011). «Исследования колокализации одиночных молекул проливают свет на идею полного излучения по сравнению с темными одиночными квантовыми точками». Маленький. 7 (14): 2101–2108. Дои:10.1002 / smll.201100802. PMID  21710484.
  6. ^ Конер А.Л., Крндия Д., Хоу К., Шерратт Д.Д., Ховарт М. (2013). «Наночастицы сопряженного полимера с концевыми гидроксильными группами имеют яркую фракцию, близкую к единице, и демонстрируют холестерин-зависимую зависимость нанодоменов IGF1R». САУ Нано. 7 (2): 1137–1144. Дои:10.1021 / nn3042122. PMID  23330847.
  7. ^ Гарсия-Парахо М.Ф., Сегерс-Нолтен Г.М., Веерман Дж.А., Греве Дж., Ван Хюльст Н.Ф. (2000). «Управляемая светом динамика излучения флуоресценции в отдельных зеленых флуоресцентных белковых молекулах в реальном времени». PNAS. 97 (13): 7237–7242. Дои:10.1073 / пнас.97.13.7237. PMID  10860989.
  8. ^ J. Mater. Chem. С, 2019, 7, 12373. Цитировать журнал требует | журнал = (помощь); Отсутствует или пусто | название = (помощь)CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  9. ^ Liu, J .; Liu, C .; Он, W. (2013), "Флуорофоры и их применение в качестве молекулярных зондов в живых клетках", Curr. Орг. Chem., 17 (6): 564–579, Дои:10.2174/1385272811317060003
  10. ^ Хуан Карлос Штокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). "Глава 4 Флуоресцентные этикетки". Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни. Издательство Bentham Science. С. 96–134. ISBN  978-1-68108-519-7. Получено 24 декабря 2017.
  11. ^ Omlc.ogi.edu
  12. ^ а б c d е Columbia Biosciences
  13. ^ Сырбу, Думитру; Лули, Саймир; Лесли, Джек; Окли, Фиона; Беннистон, Эндрю С. (2019). «Улучшенная оптическая визуализация in vivo воспалительного ответа на острое повреждение печени у мышей C57BL / 6 с использованием очень яркого красителя BODIPY в ближнем инфракрасном диапазоне». ChemMedChem. 14 (10): 995–999. Дои:10.1002 / cmdc.201900181. ISSN  1860-7187. PMID  30920173.
  14. ^ Таки, Масаясу (2013). «Глава 5. Визуализация и определение кадмия в клетках». В Астрид Сигель; Гельмут Сигель; Роланд К. О. Сигель (ред.). Кадмий: от токсикологии к сущности. Ионы металлов в науках о жизни. 11. Springer. С. 99–115. Дои:10.1007/978-94-007-5179-8_5. PMID  23430772.
  15. ^ Сырбу, Думитру; Мясник, Джон Б.; Waddell, Paul G .; Андраш, Питер; Беннистон, Эндрю С. (18.09.2017). "Локально возбужденные красители, связанные с переносом заряда, в качестве оптически чувствительных нейронных пробников" (PDF). Химия - Европейский журнал. 23 (58): 14639–14649. Дои:10.1002 / chem.201703366. ISSN  0947-6539. PMID  28833695.
  16. ^ Цзян, Сицянь; Ван, Линфэй; Кэрролл, Шайна Л .; Чен, Цзяньвэй; Wang, Meng C .; Ван, Цзинь (20.08.2018). «Проблемы и возможности для малых молекул флуоресцентных зондов в окислительно-восстановительной биологии». Антиоксиданты и редокс-сигналы. 29 (6): 518–540. Дои:10.1089 / ars.2017.7491. ISSN  1523-0864. ЧВК  6056262. PMID  29320869.

внешняя ссылка