Окрашивание - Staining

Запятнанный гистологический образец, зажатый между стаканом предметное стекло микроскопа.

Окрашивание это метод, используемый для увеличения контраста в образцах, обычно на микроскопический уровень. Пятна и красители часто используются в гистология (исследование ткани под микроскопом) и в медицинский поля гистопатология, гематология, и цитопатология которые сосредоточены на исследовании и диагнозы из болезнь на микроскопическом уровне. Пятна могут использоваться для определения биологические ткани (выделение, например, мышечные волокна или же соединительная ткань ), клетка популяции (классифицируя разные кровяные клетки ), или же органеллы внутри отдельных ячеек.

В биохимия это включает добавление специфичного для класса (ДНК, белки, липиды, углеводы ) красить субстрат для определения или количественной оценки присутствия конкретного соединения. Окрашивание и флуоресцентная маркировка могут служить аналогичным целям. Биологическое окрашивание также используется для маркировки клеток в проточной цитометрии, и отметить белки или же нуклеиновые кислоты в гель-электрофорез.

Окрашивание не ограничивается биологическими материалами, оно также может использоваться для изучения структуры других материалов, например, ламеллярных структур полукристаллических материалов. полимеры или доменные структуры блок-сополимеры.

В естественных условиях против В пробирке

В естественных условиях окрашивание (также называемый витальное окрашивание или прижизненное окрашивание) - это процесс окрашивания живых тканей. Заставляя определенные клетки или структуры приобретать контрастный цвет (а), их форма (морфология ) или положение в клетке или ткани можно легко увидеть и изучить. Обычная цель - выявить цитологические детали, которые иначе могли бы быть неочевидными; однако окрашивание также может выявить, где в клетках или тканях происходят определенные химические вещества или определенные химические реакции.

В пробирке окрашивание включает окрашивание клеток или структур, которые были удалены из их биологического контекста. Некоторые пятна часто объединяются, чтобы выявить больше деталей и особенностей, чем отдельное пятно. В сочетании со специальными протоколами для фиксация и подготовки проб, ученые и врачи могут использовать эти стандартные методы в качестве последовательных, повторяемых диагностических инструментов. А контрастировать это пятно, которое делает клетки или структуры более заметными, если не полностью видно с основным пятном.

• Кристаллический фиолетовый окрашивает как грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы. Обработка спиртом удаляет кристаллический фиолетовый цвет только у грамотрицательных организмов. Сафранин в качестве контрастного красителя используется для окрашивания грамотрицательных организмов, обесцвеченных алкоголем.

В условиях ex vivo многие клетки продолжают жить и метаболизировать, пока не «закрепятся». Некоторые методы окрашивания основаны на этом свойстве. Те пятна, которые исключены живыми клетками, но поглощены уже мертвыми клетками, называются жизненно важные пятна (например. трипановый синий или же иодид пропидия для эукариотических клеток). Те, что проникают в живые клетки и окрашивают их, называются суправитальные пятна (например. Новый метиленовый синий и блестящий крезиловый синий за ретикулоцит окрашивание). Однако в конечном итоге эти пятна токсичны для организма, некоторые в большей степени, чем другие. Частично из-за их токсического взаимодействия внутри живой клетки, когда суправитальные пятна попадают в живую клетку, они могут давать характерный паттерн окрашивания, отличный от окрашивания уже фиксированной клетки (например, вид «ретикулоцитов» по ​​сравнению с диффузной «полихромазией»). Для достижения желаемого эффекта красители используются в очень разбавленных растворах от 1:5000 к 1:500000 (Хоуи, 2000). Обратите внимание, что многие красители можно использовать как в живых, так и в фиксированных клетках.

Микроскопия в окрашивании

Обычный микроскоп, используемый при окрашивании, - это светлопольный микроскоп. Светлопольный микроскоп относится к категории световых микроскопов из-за осветителя, который излучает свет для создания яркого фона. Эти микроскопы обычно бинокулярные, что означает наличие двух окуляров с десятикратным увеличением. При просмотре окрашенных организмов с увеличением в тысячу раз масло необходимо, чтобы помочь создать более четкое изображение из-за искажения разрешения от преломление света что становится невероятно ярко выраженным при большом увеличении.^[1]

Подготовка

Необходимые подготовительные шаги зависят от типа запланированного анализа; Могут потребоваться некоторые или все из следующих процедур.

Влажные крепления - влажные крепления используются для наблюдения за живыми организмами и могут быть изготовлены с использованием воды и некоторых красителей. Жидкость добавляется на предметное стекло перед добавлением микроорганизмов, и покровное стекло помещается на образец в воде и окрашивается, чтобы помочь удержать его внутри поле зрения.^[1]

Фиксация- который сам по себе может состоять из нескольких шагов - направлен на максимальное сохранение формы вовлеченных клеток или тканей. Иногда тепловая фиксация используется для уничтожения, прилипания и изменения образца, чтобы он впитывал пятна. Большинство химических фиксаторов (химические вещества, вызывающие фиксацию) производят химические связи между белки и другие вещества в образце, увеличивающие их жесткость. Общие фиксаторы включают формальдегид, этиловый спирт, метанол, и / или пикриновая кислота. Кусочки ткани могут быть встроены в парафиновая свеча для повышения их механической прочности и стабильности, а также для облегчения нарезки тонкими ломтиками.^[2]Протравливание: Это химические вещества, которые могут окрашивать материалы, которые иначе не поддаются окрашиванию.

Протравы делятся на две категории:

а) Основная протрава: вступает в реакцию с кислотными красителями, например квасцы, сульфат железа, хлорид цетилпиридиния и т. д.

б) Кислая протрава: вступает в реакцию с основными красителями, например. пикриновая кислота, дубильная кислота и др.

^[2]Прямое окрашивание: Осуществляется без протравы.

Непрямое окрашивание: Окрашивание нанесено с помощью протравы.

Проницаемость включает обработку клеток с (обычно) легкой поверхностно-активное вещество. Это лечение растворяет клеточные мембраны, и позволяет более крупным молекулам красителя проникать внутрь клетки.

Монтаж обычно включает прикрепление образцов к предметному стеклу микроскопа для наблюдения и анализа. В некоторых случаях клетки можно выращивать прямо на предметном стекле. Для образцов рыхлых клеток (например, мазка крови или мазок Папаниколау ) образец можно наносить непосредственно на слайд. Для более крупных кусков ткани делаются тонкие срезы (срезы) с использованием микротом; затем эти срезы можно смонтировать и проверить.

Стандартизация

Большинство красителей, обычно используемых в микроскопии, доступны в виде Пятна, сертифицированные BSC. Это означает, что образцы партии производителя были протестированы независимым органом, Комиссия по биологическим пятнам (BSC), и было установлено, что они соответствуют или превосходят определенные стандарты чистоты, содержания красителя и эффективности в методах окрашивания, что обеспечивает более точное выполнение экспериментов и более надежные результаты. Эти стандарты опубликованы в журнале Комиссии. Биотехника и гистохимия.^[3] Состав многих красителей у разных поставщиков неодинаков. Использование красителей, сертифицированных BSC, устраняет источник неожиданных результатов.^[4]

Некоторые продавцы продают пятна, «сертифицированные» ими, а не Комиссией по биологическим пятнам. Такие продукты могут подходить или не подходить для диагностических и других приложений.^[5]

Отрицательное окрашивание

Пример отрицательное окрашивание

Простой метод окрашивания на бактерии, который обычно бывает успешным, даже если положительное окрашивание методы терпят неудачу, заключается в использовании отрицательное пятно. Этого можно добиться, размазав образец по предметному стеклу, а затем нанеся нигрозин (черный синтетический краситель) или Тушь (водная суспензия углеродных частиц). После высыхания микроорганизмы можно рассматривать под микроскопом в светлом поле как более светлые включения, хорошо контрастирующие с окружающей их темной средой.^[6] Отрицательное окрашивание может окрашивать фон, а не организмы, потому что клеточная стенка микроорганизмов обычно имеет отрицательный заряд, который отталкивает отрицательно заряженное пятно. Красители, используемые при отрицательном окрашивании, являются кислыми.^[1] Примечание: отрицательное окрашивание - это мягкий метод, который не может уничтожить микроорганизмы, и поэтому не подходит для изучения патогенов.

Положительное окрашивание

В отличие от отрицательного окрашивания, при положительном окрашивании используются базовые красители для окрашивания образца на ярком фоне. Пока хромофор используется как для отрицательного, так и для положительного окрашивания, тип хромофора, используемый в этом методе, представляет собой положительно заряженный ион, а не отрицательный. Отрицательно заряженная клеточная стенка многих микроорганизмов притягивает положительно заряженный хромофор, в результате чего образец впитывает пятно, придавая ему цвет используемого красителя. Положительное окрашивание используется в микробиологии чаще, чем отрицательное. Ниже перечислены различные типы положительного окрашивания.^[1]

Простое окрашивание против дифференциального окрашивания

Простое окрашивание - это метод, при котором на слайде одновременно используется только один тип окрашивания. Поскольку используется только одно пятно, образцы (для положительных пятен) или фон (для отрицательных пятен) будут одного цвета. Поэтому простые красители обычно используются для просмотра только одного организма на слайде. При дифференциальном окрашивании используется несколько красок на предметное стекло. В зависимости от используемых красителей организмы с разными свойствами будут иметь разные цвета, что позволяет классифицировать несколько образцов. Дифференциальное окрашивание также можно использовать для окраски различных органелл в одном организме, что можно увидеть на окрашивание эндоспор.^[1]

Типы техник окрашивания^[7]

Конкретные техники

Окрашивание по Граму

Окрашивание по Граму используется для определения граммового статуса и классификации бактерий в широком смысле на основе состава их клеточная стенка. Окрашивание по Граму использует кристально-фиолетовый окрашивать стенки клеток, йод (в качестве протравы) и фуксин или же сафранин контрастировать (отметьте все бактерии). Статус по Граму помогает разделить образцы бактерий на две группы, обычно представляющие их филогенез. Эта характеристика в сочетании с другими методами делает его полезным инструментом в лабораториях клинической микробиологии, где он может быть важным при раннем выборе подходящих антибиотики.^[8]

На большинстве препаратов, окрашенных по Граму, Грамотрицательный организмы кажутся красными или розовыми из-за их контрастного окрашивания. Из-за более высокого содержания липидов после обработки спиртом пористость клеточной стенки увеличивается, следовательно, комплекс CVI (кристаллический фиолетовый - йод) может проходить через нее. Таким образом, основное пятно не сохраняется. Кроме того, в отличие от большинства грамположительных бактерий, грамотрицательные бактерии имеют только несколько слоев пептидогликана и вторичную клеточную мембрану, состоящую в основном из липополисахарида.

Окрашивание эндоспор

Окрашивание эндоспор используется для определения наличия или отсутствия эндоспоры, которые затрудняют уничтожение бактерий. Доказано, что споры бактерий трудно окрашивать, поскольку они не проницаемы для водных красителей. Окрашивание эндоспор особенно полезно для выявления бактерий, образующих эндоспоры. патогены Такие как Clostridium difficile. До разработки более эффективных методов это окрашивание выполняли методом Виртца с термофиксацией и контрастированием. Благодаря использованию малахитового зеленого и разбавленного соотношения карбол-фуксина, фиксация бактерий в осмиевой кислоте была отличным способом гарантировать отсутствие смешивания красителей. Однако недавно пересмотренные методы окрашивания значительно сократили время, необходимое для создания этих пятен. Этот пересмотр включал замену карбол-фуксина водным сафранином в сочетании с недавно разбавленной 5% формулой малахитового зеленого. Этот новый и улучшенный состав пятен был выполнен таким же образом, как и раньше, с использованием термофиксации, полоскания и промокания для последующего исследования. При обследовании все бактерии, образующие эндоспоры, будут окрашены в зеленый цвет, а все остальные клетки - в красный цвет. ^[9]

Пятно Циля-Нильсена

А Пятно Циля – Нильсена кислотостойкое краситель, используемый для окрашивания видов Микобактерии туберкулеза которые не окрашиваются стандартными лабораторными процедурами окрашивания, такими как окрашивание по Граму.

Это пятно выполняется за счет использования как красного цвета карбол фуксин который окрашивает бактерии и встречные пятна, такие как метиленовый синий.

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

Микроскопический вид гистологического образца человека легкое ткань, окрашенная гематоксилин и эозин.

Окрашивание гематоксилином и эозином часто используется в гистология для исследования срезов тонких тканей.^[10] Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, при этом эозин окрашивает цитоплазму, соединительную ткань и другие внеклеточные вещества в розовый или красный цвет.^[10] Эозин сильно всасывается красные кровяные тельца, окрашивая их в ярко-красный цвет. В искусно приготовленном препарате H&E красные кровяные тельца почти оранжевые, а коллаген и цитоплазма (особенно мышцы) приобретают разные оттенки розового.

Окрашивание по Папаниколау

Окрашивание по Папаниколау, или окрашивание PAP, было разработано для замены тонкоигольной аспирационной цитологии (FNAC) в надежде сократить время и стоимость окрашивания без ущерба для качества. Это окрашивание - часто используемый метод для исследования образцов клеток из различных типов тканей в различных органах. Окрашивание PAP претерпело несколько изменений, чтобы стать «подходящей альтернативой» для FNAC. Этот переход произошел из-за того, что ученые оценили влажные фиксированные мазки, сохраняющие структуру ядер, в отличие от непрозрачного внешнего вида высушенных на воздухе мазков Романовского. Это привело к созданию гибридного окрашивания влажной фиксации и воздушной сушки, известного как сверхбыстрое окрашивание папаниколау. Эта модификация включает использование назального физиологического раствора для регидратации клеток с целью повышения прозрачности клеток и сочетается с использованием спиртового формалина для улучшения цвета ядер. Окрашивание по папаниколау теперь используется вместо цитологического окрашивания во всех типах органов из-за его повышения морфологического качества, уменьшения времени окрашивания и снижения стоимости. Часто используется для окрашивания Мазок Папаниколау образцы.^[11] Он использует комбинацию гематоксилин, Оранжевый G, эозин Y, Светло-зеленый SF желтоватый, и иногда Бисмарк Браун Y.^{[10][11] [12]}

Окрашивание PAS

PAS диастаза показывая грибок Гистоплазма.

^[13]Периодическая кислота-Шифф это специальный краситель для гистологии, используемый для маркировки углеводы (гликоген, гликопротеин, протеогликаны ). PAS обычно используется на тканях печени, где образуются отложения гликогена, что делается для того, чтобы различать различные типы болезней накопления гликогена. PAS важен, потому что он может обнаруживать гранулы гликогена, обнаруженные в опухолях яичников и поджелудочной железы эндокринной системы, а также в мочевом пузыре и почках почечной системы. Базальные мембраны также могут отображаться при окрашивании PAS и могут быть важны при диагностике заболевания почек. Из-за большого количества углеводов в клеточной стенке гиф и дрожжевых форм грибов окрашивание Периодной кислотой по Шиффу может помочь найти эти виды в образцах тканей человеческого тела.

Трихром Массона

Трихром Массона представляет собой (как следует из названия) протокол трехцветного окрашивания. Рецепт эволюционировал из оригинальной техники Массона для различных конкретных применений, но все они хорошо подходят для различения клеток от окружающей среды. соединительная ткань. В большинстве рецептов получается красный кератин и мышечные волокна, окрашивание в синий или зеленый цвет коллаген и кость, светло-красное или розовое окрашивание цитоплазма и черный ядра клеток.

Романовские пятна

В Романовские пятна считается эффектом полихромного окрашивания и основан на комбинации эозина плюс (химически уменьшенный эозин ) и деметилированный метиленовый синий (содержащий продукты окисления лазурный А и лазурный B ). Это окрашивание проявляет различные цвета для всех клеточных структур («эффект Романовского-Гимзы») и поэтому использовалось для окрашивания полиморфов нейтрофилов и ядер клеток. Общие варианты включают Пятно Райта, Пятно Дженнера, Пятно Мая-Грюнвальда, Пятно лейшмана и Пятно Гимзы.

Все используются для изучения кровь или же Костный мозг образцы. Они предпочтительнее H&E для исследования клеток крови, потому что разные типы лейкоциты (белые кровяные тельца) легко различимы. Все они также подходят для исследования крови на наличие паразитов, передающихся через кровь, таких как малярия.^[14]

Окрашивание серебром

Гемёри метенамин серебряная морилка демонстрация гистоплазма (показано черным цветом).

Окрашивание серебром это использование серебро окрашивать гистологические срезы. Такое окрашивание важно для демонстрации белки (например тип III коллаген ) и ДНК. Используется, чтобы показать как вещества внутри, так и снаружи клетки. Окрашивание серебром также используется в гель-электрофорез в градиенте температуры.

Аргентафиновые клетки уменьшать раствор серебра в металлическое серебро после формалин фиксация. Этот метод был открыт итальянцем Камилло Гольджи, используя реакцию между нитрат серебра и дихромат калия, осаждая таким образом хромат серебра в некоторых клетках (см. Метод Гольджи ). Аргирофильные клетки восстановите раствор серебра до металлического серебра после воздействия на пятно, содержащее восстановитель. Примером этого может быть гидрохинон или формалин.

Окрашивание суданом

Окрашивание суданом использует судановые красители для окрашивания суданофильных веществ, часто включая липиды. Судан III, Судан IV, Масло Red O, Четырехокись осмия, и Судан Блэк Б часто используются. Окрашивание суданом часто используется для определения уровня фекальный жир в диагностике стеаторея.

Окрашивание Виртца-Конклина

Окрашивание Виртца-Конклина - это специальная техника, разработанная для окрашивания настоящих эндоспор с использованием красителя малахитовый зеленый в качестве основного красителя и сафранина в качестве контрастного красителя. После окрашивания они не обесцвечиваются. Добавление тепла во время процесса окрашивания является огромным фактором.^[15] Тепло помогает открыть мембрану спор, чтобы краситель мог проникнуть внутрь. Основная цель этого красителя - показать прорастание спор бактерий. Если идет процесс прорастания, то спора станет зеленой из-за малахитового зеленого цвета, а окружающая клетка станет красной из-за сафранина. Это пятно также может помочь определить ориентацию спор внутри бактериальной клетки; будь то терминал (на кончике), субтерминальный (внутри ячейки) или центральный (полностью в середине ячейки).

Коллагеновый гибридизирующий пептидное окрашивание

Коллагеновый гибридизующий пептид Окрашивание (CHP) позволяет легко и напрямую окрашивать денатурированные коллагены любого типа (Тип I, II, IV и т. Д.), Независимо от того, были ли они повреждены или разложены ферментативными, механическими, химическими или термическими способами. Они работают, свертываясь в тройную спираль коллагена с доступными одиночными нитями в ткани. ТЭЦ можно визуализировать с помощью простого флуоресцентный микроскоп.

Общие биологические пятна

Различные пятна реагируют или концентрируются в разных частях клетки или ткани, и эти свойства используются для выявления определенных частей или областей. Некоторые из наиболее распространенных биологических пятен перечислены ниже. Если не указано иное, все эти красители можно использовать с фиксированными клетками и тканями; отмечены витальные красители (пригодные для использования с живыми организмами).

Акридиновый апельсин

Акридиновый апельсин (АО) представляет собой селективный флуоресцентный катионный краситель нуклеиновых кислот, используемый для определения клеточного цикла. Он проницаем для клеток и взаимодействует с ДНК и РНК посредством интеркаляции или электростатического притяжения. Когда он связан с ДНК, он очень похож по спектру на флуоресцеин. Подобно флуоресцеину, он также может использоваться в качестве неспецифического красителя для подсветки традиционно окрашенных клеток на поверхности твердого образца ткани (окрашивание с подсветкой флуоресценции^[16]).

Бисмарк коричневый

^[17]Бисмарк коричневый (также Бисмарк коричневый Y или манчестерский коричневый) придает желтый цвет кислоте муцины. и интенсивный коричневый цвет тучных клеток. Одно из значений этого пятна по умолчанию состоит в том, что оно скрывает любую окружающую его структуру и снижает качество контраста. Чтобы оно было полезным, его нужно сочетать с другими пятнами.Некоторыми дополнительными красителями, используемыми вместе с коричневым Бисмарком, являются гематоксилин и толуидиновый синий, которые обеспечивают лучший контраст в гистологическом образце.

Кармин

Кармин окрашивание паразитического плоского червя.

Кармин ярко-красный краситель, используемый для окрашивания гликоген, в то время как карминные квасцы представляют собой ядерное пятно. Карминовые пятна требуют использования протравы, обычно алюминий.

Кумасси синий

Кумасси синий (также бриллиантовый синий) неспецифически окрашивает белки в ярко-синий цвет. Его часто используют в гель-электрофорезе.

Крезил фиолетовый

Крезил фиолетовый окрашивает кислые компоненты цитоплазмы нейронов в фиолетовый цвет, в частности Nissl тела. Часто используется в исследованиях мозга.

Кристально-фиолетовый

Кристально-фиолетовый, в сочетании с подходящей протравой, пятна клеточные стенки фиолетовый. Кристаллический фиолетовый - это краситель, используемый при окрашивании по Граму.

DAPI

DAPI это флуоресцентный ядерное пятно, возбужденное ультрафиолетовый светится и проявляет сильную синюю флуоресценцию при соединении с ДНК. DAPI связывается с A = T-богатыми повторами хромосом. DAPI также не виден при обычной просвечивающей микроскопии. Его можно использовать в живых или фиксированных клетках. Клетки, окрашенные DAPI, особенно подходят для подсчета клеток.^[18]

Эозин

Эозин чаще всего используется в качестве контрастного красителя гематоксилину, придавая розовый или красный цвет цитоплазматический материал клеточные мембраны, и некоторые внеклеточные структуры. Он также придает сильный красный цвет красные кровяные тельца. Эозин также может использоваться в качестве контрастного красителя в некоторых вариантах окрашивания по Граму и во многих других протоколах. На самом деле существует два очень близких соединения, обычно называемых эозином. Чаще всего используется эозин Y (также известный как эозин Y ws или эозин желтоватый); он имеет слегка желтоватый оттенок. Другое соединение эозина - это эозин B (эозин голубоватый или имперский красный); у него очень слабый голубоватый оттенок. Эти два красителя взаимозаменяемы, и использование того или другого является скорее вопросом предпочтений и традиций.

Этидиум бромид

Этидиум бромид вставки и окрашивает ДНК, обеспечивая флуоресцентное красно-оранжевое окрашивание. Хотя он не окрашивает здоровые клетки, его можно использовать для идентификации клеток, находящихся на последних стадиях апоптоз - такие клетки намного проницаемы мембраны. Следовательно, бромистый этидий часто используется в качестве маркера апоптоза в популяциях клеток и для определения местоположения полос ДНК в гель-электрофорез. Пятно также можно использовать вместе с акридиновый апельсин (АО) в подсчете жизнеспособных клеток. Это комбинированное окрашивание EB / AO заставляет живые клетки флуоресцировать зеленым, в то время как апоптозные клетки сохраняют характерную красно-оранжевую флуоресценцию.

Кислый фуксин

Кислый фуксин может использоваться для окрашивания коллагена, гладких мышц или митохондрии. Кислый фуксин используется в качестве ядерного и цитоплазматического красителя в методе трихрома Мэллори. Кислый фуксин окрашивает цитоплазму в некоторых вариантах трихрома Массона. В пикрофуксине Ван Гизона кислый фуксин придает красный цвет коллагеновым волокнам. Кислый фуксин также является традиционным красителем для митохондрий (метод Альтмана).

Гематоксилин

Гематоксилин (гематоксилин в Северной Америке) - это ядерное пятно.^[10] Используется с протравой, окрашивающей ядра гематоксилином в сине-фиолетовый или коричневый цвет.^[10] Чаще всего используется с эозином в H&E пятно (гематоксилин и эозин) окрашивание, одна из самых распространенных процедур в гистология.^[10]

Пятна Hoechst

Hoechst это биспроизводное бензимидазола, которое связывается с малая бороздка из ДНК. Пятна Hoechst, часто используемые в флуоресцентной микроскопии для окрашивания ДНК, выглядят желтыми при растворении в водных растворах и излучают синий свет при УФ-возбуждении. Есть два основных типа Hoechst: Hoechst 33258 и Hoechst 33342. Эти два соединения функционально похожи, но имеют небольшую разницу в структуре. Hoechst 33258 содержит терминал гидроксил группа и, таким образом, более растворима в водном растворе, однако эти характеристики снижают ее способность проникать в плазматическая мембрана. Hoechst 33342 содержит этил замена концевой гидроксильной группы (т.е.этиловой эфирной группы), что делает ее более гидрофобной для облегчения прохождения через плазматическую мембрану

Йод

Йод используется в химия как индикатор крахмал. Когда крахмал смешивается с йодом в растворе, появляется интенсивный темно-синий цвет, представляющий комплекс крахмал / йод. Крахмал - это вещество, обычное для большинства растительных клеток, поэтому слабый раствор йода окрашивает крахмал, присутствующий в клетках. Йод - один из компонентов метода окрашивания, известного как Окрашивание по Граму, используется в микробиология. Используется как едкий при окрашивании по Граму йод усиливает проникновение красителя через поры, присутствующие в клеточной стенке / мембране.

Раствор Люголя или йод Люголя (IKI) представляет собой раствор коричневого цвета, который становится черным в присутствии крахмалов и может использоваться в качестве окрашивания клеток, делая клетки ядра более заметный.

Раствор Люголя используется с обычным уксусом (уксусной кислотой), чтобы идентифицировать предраковые и раковые изменения в тканях шейки матки и влагалища во время контрольных исследований «Пап-мазок» при подготовке к биопсии. Уксусная кислота заставляет аномальные клетки бледнеть, а нормальные ткани окрашивают йод в коричневый цвет красного дерева.^[19]

Малахитовый зеленый

Малахитовый зеленый (также известный как ромбовидный зеленый B или викторианский зеленый B) может использоваться как сине-зеленое контрастное пятно для сафранина в Техника окрашивания по Гименесу для бактерий. Его также можно использовать для прямого окрашивания споры.

Метиловый зеленый

Метиловый зеленый обычно используется с светлопольными микроскопами, а также с флуоресцентными микроскопами ^[20] окрашивать хроматин клеток, чтобы их было легче рассмотреть.

Метиленовый синий

Метиленовый синий используется для окрашивания клеток животных, таких как клетки щек человека, чтобы сделать их ядра более заметными. Также используется для окрашивания мазков крови в цитологии.

Нейтральный красный

Нейтральный красный (или толуиленовый красный) пятна Вещество Ниссля красный. Обычно его используют в качестве контрастного красителя в сочетании с другими красителями.

Нильский синий

Нильский синий (или Нильский синий А) окрашивает ядра в синий цвет. Его можно использовать с живыми клетками.

Нильский красный

Нильский красный (также известный как оксазон нильского синего) образуется при кипячении нильского синего с серная кислота. Это дает смесь нильского красного и нильского синего. Нильский красный - это липофильный пятно; он будет накапливаться в липид глобулы внутри клеток, окрашивая их в красный цвет. Нильский красный можно использовать с живыми клетками. Он сильно флуоресцирует при разделении на липиды, но практически не светится в водном растворе.

Тетраоксид осмия (официальное название: тетраоксид осмия)

Тетраоксид осмия используется в оптической микроскопии для окрашивания липиды. Он растворяется в жирах и восстанавливается органическими веществами до элементарного осмия, легко видимого черного вещества.

Пропидия йодид

Иодид пропидия представляет собой флуоресцентный интеркалирующий агент, который можно использовать для окрашивания клеток. Иодид пропидия используется в качестве окраски ДНК в проточной цитометрии для оценки жизнеспособности клеток или содержания ДНК в анализе клеточного цикла или в микроскопии для визуализации ядра и других ДНК-содержащих органелл. Йодид пропидия не может проникать через мембрану живых клеток, что делает его полезным для дифференциации некротических, апоптотических и здоровых клеток. PI также связывается с РНК, что требует обработки нуклеазами, чтобы различать окрашивание РНК и ДНК.

Родамин

Родамин представляет собой белок-специфический флуоресцентный краситель, обычно используемый в флуоресцентной микроскопии.

Сафранин

Сафранин (или сафранин О) - красный катионный краситель. Он связывается с ядрами (ДНК) и другими тканевыми полианионами, включая гликозаминогликаны в хрящевых и тучных клетках, а также с компонентами лигнина и пластид в тканях растений.^[21] Сафранин не следует путать с шафраном, дорогим натуральным красителем, который используется в некоторых методах для придания коллагену желтого цвета, чтобы контрастировать с синим и красным цветами, которые другие красители придают ядрам и цитоплазме в тканях животных (включая человека).

Неправильное написание «сафранин» широко используется. Окончание -ine подходит для сафранина О, потому что этот краситель является амином,^[22][23][4]

Сохраняемость тканей

Ткани, впитывающие пятна, называются хроматический. Хромосомы были названы так из-за их способности впитывать фиолетовые пятна.

Положительное сродство к конкретному красителю может быть обозначено суффиксом -фильный. Например, ткани, окрашенные лазурное пятно можно назвать азурофильный. Это также может быть использовано для более общих свойств окрашивания, таких как ацидофильный для тканей, окрашиваемых кислый пятна (особенно эозин ), базофильный при окрашивании базовый красители и амфофильный^[24] при окрашивании кислотными или основными красителями. В отличие, хромофобный ткани плохо впитывают цветной краситель.

Электронная микроскопия

Как и в световой микроскопии, красители можно использовать для усиления контраста в просвечивающая электронная микроскопия. Обычно используются электронно-плотные соединения тяжелых металлов.

Фосфорновольфрамовая кислота

^[25]Фосфорновольфрамовая кислота общий отрицательное пятно за вирусы, нервы, полисахариды, и другие биологические тканевые материалы. Он в основном используется в форме 0,5–2% pH, что делает его нейтральным, и в сочетании с водой образует водный раствор. Фосфорновольфрамовая кислота заполнена электронно-плотным веществом, которое окрашивает фон, окружающий образец, темным, а сам образец - светлым. Этот процесс не является нормальным положительным методом окрашивания, когда образец темный, а фон остается светлым.

Четырехокись осмия

Четырехокись осмия используется в оптической микроскопии для окрашивания липиды. Он растворяется в жирах и восстанавливается органическими веществами до элементарного осмия, легко видимого черного вещества. Поскольку это тяжелый металл, который поглощает электроны, это, пожалуй, наиболее распространенный краситель, используемый для морфологии в биологической электронной микроскопии. Он также используется для окрашивания различных полимеров с целью изучения их морфологии с помощью ПЭМ. OsO
₄ очень летуч и чрезвычайно токсичен. Это сильный окислитель, так как осмий имеет степень окисления +8. Он агрессивно окисляет многие материалы, оставляя после себя отложения нелетучего осмия в более низкой степени окисления.

Четырехокись рутения

Четырехокись рутения столь же летуч и даже более агрессивен, чем тетраоксид осмия, и способен окрашивать даже материалы, устойчивые к пятнам осмия, например полиэтилен.

Другие химические вещества, используемые при окрашивании с помощью электронной микроскопии, включают:молибдат аммония, йодид кадмия, карбогидразид, хлорид железа, гексамин, трихлорид индия, нитрат лантана, ацетат свинца, цитрат свинца, нитрат свинца (II), периодная кислота, фосфорномолибденовая кислота, феррицианид калия, ферроцианид калия, рутений красный, нитрат серебра, протеинат серебра, хлораурат натрия, нитрат таллия, тиосемикарбазид, уранилацетат, уранилнитрат, и сульфат ванадила.

Смотрите также

• Цитология: исследование клеток
• Гистология: исследование тканей
• Иммуногистохимия: использование антисывороток для мечения специфических антигенов
• Трис (дисульфонат батофенантролина) рутения (II), белковый краситель.
• Жизненно важное пятно: пятна, не убивающие клетки
• СТРАНИЦА: разделение белковых молекул
• Клизма бария - тип окраски in vivo, создающий контраст в рентгеновской части светового спектра

Рекомендации

дальнейшее чтение

внешняя ссылка

• Комиссия по биологическим пятнам - независимая некоммерческая компания, которая тестирует красители с начала 1920-х годов и выдает Сертификаты одобрения на партии красителей, которые соответствуют международно признанным стандартам.
• ПятнаФайл Справочник по красителям и методам окрашивания.
• Жизненно важное окрашивание простейших и соответствующие методы временного монтажа ~ Хоуи, 2000
• Кстати о фиксации: часть 1 и Часть 2 - М. Халит Умар
• Микрофотографии гистологических пятен
• Часто задаваемые вопросы в упражнениях по окрашиванию на домашней странице Шридхара Рао П.Н.