Гель-электрофорез в градиенте температуры - Temperature gradient gel electrophoresis

Негативное изображение геля DGGE, окрашенного бромистым этидием

Гель-электрофорез в градиенте температуры (TGGE) и денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) являются формами электрофорез которые используют температурный или химический градиент для денатурирования образца, когда он движется через акриламид гель. TGGE и DGGE можно применять к нуклеиновым кислотам, таким как ДНК и РНК и (реже) белки. TGGE полагается на температурно-зависимые изменения структуры для разделения нуклеиновых кислот. DGGE разделяет гены одинакового размера на основе их различной денатурирующей способности, которая определяется их последовательностью пары оснований. DGGE был оригинальной техникой, а TGGE - ее усовершенствованием.

История

DGGE был изобретен Леонард Лерман, в то время как он был профессором SUNY Albany.[1][2][3]

Это же оборудование можно использовать для анализа белок, который впервые сделал Томас Э. Крейтон из MRC Лаборатория молекулярной биологии, Кембридж, Англия.[4] Сходные на вид структуры производятся белками и нуклеиновыми кислотами, но фундаментальные принципы совершенно разные.

TGGE был впервые описан Тэтчер и Ходсоном. [5] и по Роджер Уортелл Технологии Джорджии. Большая работа была проделана группой Риснера в Германии. Коммерческое оборудование для DGGE можно приобрести у компаний Bio-Rad, INGENY и CBS Scientific; система для TGGE доступна от Biometra.

Гель-электрофорез в градиенте температуры

ДНК имеет отрицательный заряд и поэтому будет перемещаться к положительному электроду в электрическом поле. Гель представляет собой молекулярную сетку с отверстиями примерно такого же размера, как диаметр нити ДНК. При приложении электрического поля ДНК начинает двигаться через гель со скоростью, примерно обратно пропорциональной длине молекулы ДНК (более короткие участки ДНК перемещаются быстрее) - это основа для разделения в зависимости от размера в стандарте. электрофорез.

В TGGE также существует температурный градиент в геле. При комнатной температуре ДНК будет стабильно существовать в двухцепочечной форме. При повышении температуры пряди начинают отделяться (таяние ), и скорость их движения через гель резко снижается. Критически важно, что температура, при которой происходит плавление, зависит от последовательности (пары оснований GC более стабильны, чем AT из-за взаимодействий стэкинга, а не из-за разницы в водородных связях[нужна цитата ] (есть три водородные связи между цитозин и гуанин базовая пара, но только две между аденин и тимин )), поэтому TGGE предоставляет "зависимый от последовательности, независимый от размера метод" для разделения молекул ДНК. TGGE разделяет молекулы и дает дополнительную информацию о плавлении и стабильности (Biometra, 2000).

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) работает путем нанесения небольшого образца ДНК (или РНК) на гель для электрофореза, который содержит денатурирующий агент. Исследователи обнаружили, что определенные денатурирующие гели способны вызывать плавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется через гель и может быть проанализирована на отдельные компоненты, даже на такие маленькие, как 200-700. пар оснований.

Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным денатурирующим условиям, расплавленные цепи полностью фрагментируются на отдельные цепи. Процесс денатурации денатурирующего геля очень резок: «Вместо того, чтобы частично плавиться непрерывно, подобно застежке-молнии, большинство фрагментов плавятся поэтапно. Отдельные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в пределах очень короткого промежутка времени. узкий диапазон денатурирующих условий »(Helms, 1990). Это позволяет различать различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательностях фрагментов одинаковой длины часто заставляют их частично плавиться в разных положениях градиента и, следовательно, «останавливаться» в разных положениях геля. Путем сравнения плавления полиморфный Фрагменты ДНК бок о бок на денатурирующих градиентных гелях можно обнаружить фрагменты, которые имеют мутации в первом домене плавления (Helms, 1990). Поместите два образца рядом на геле и дайте им возможность денатурировать Вместе исследователи могут легко увидеть даже самые незначительные различия в двух образцах или фрагментах ДНК.

У этого метода есть ряд недостатков: «Химические градиенты, такие как те, что используются в DGGE, не так воспроизводимы, их трудно установить и часто не удается полностью устранить. гетеродуплексы "(Westburg, 2001). Эти проблемы решает TGGE, который использует температурный, а не химический градиент для денатурирования образца.

Метод

Чтобы отделить нуклеиновые кислоты с помощью TGGE, необходимо выполнить следующие шаги: подготовка и заливка гелей, электрофорез, окрашивание и элюирование ДНК. Потому что буферизованный Система должна быть выбрана, важно, чтобы система оставалась стабильной в контексте повышения температуры. Таким образом, мочевина обычно используется для приготовления геля; однако исследователи должны знать, что количество используемой мочевины повлияет на общую температуру, необходимую для разделения ДНК.[6] Гель загружается, образец помещается на гель в соответствии с типом используемого геля, т.е. параллельно или перпендикулярно - напряжение регулируется, и образец можно оставить для работы.[6] В зависимости от того, какой тип TGGE будет запущен, либо перпендикуляр или параллельно необходимо подготовить и загрузить различное количество образца. Большее количество одного образца используется с перпендикуляром, в то время как меньшее количество многих образцов используется с параллельным TGGE. После нанесения геля его необходимо окрасить для визуализации результатов. Хотя для этой цели можно использовать ряд пятен, окрашивание серебром оказался самым эффективным инструментом.[6] ДНК может быть элюирована серебряным пятном для дальнейшего анализа с помощью ПЦР усиление.[6]

Приложения

TGGE и DGGE широко используются в биомедицинских и экологических исследованиях; выбранные приложения описаны ниже.

Мутации в мтДНК

Согласно недавнему расследованию Вонга, Ляна, Квона, Бая, Альпера и Гропмана,[нужна цитата ] TGGE можно использовать для исследования митохондриальная ДНК человека. По мнению этих авторов, TGGE использовался для определения двух новых мутации в митохондриях геном: "21-летняя женщина, которая подозревалась в митохондриальной цитопатии, но не имела точечных мутаций и делеций митохондриальной ДНК (мтДНК), прошла скрининг на неизвестные мутации во всем митохондриальном геноме с помощью гель-электрофореза в градиенте температуры ».[7]

мутация p53 в секрете поджелудочной железы

Отчет Лора и его коллег (2001)[нужна цитата ] что в комплексном исследовании панкреатический выделения лиц без поджелудочной железы карцинома, p53 мутации можно было обнаружить в соках поджелудочной железы у небольшого процента участников. Поскольку мутации p53 были широко обнаружены в карциномах поджелудочной железы, исследователи этого исследования пытались определить, может ли сама мутация быть связана с развитием рака поджелудочной железы. Хотя Лор смог обнаружить мутации p53 через TGGE у нескольких субъектов, ни у одного из них впоследствии не развилась карцинома поджелудочной железы. Таким образом, исследователи делают вывод, отмечая, что мутация p53 не может быть единственным индикатором онкогенеза карциномы поджелудочной железы.

Микробная экология

ДГГЭ малых рибосомальный гены, кодирующие субъединицы, были впервые описаны Джерард Муйзер,[8] пока он был постдоком в Лейденский университет, и стал широко используемым методом в микробной экологии.

ПЦР-амплификация ДНК, выделенной из смешанных микробных сообществ, с праймерами для ПЦР, специфичными для фрагментов гена 16S рРНК бактерии и археи, и фрагменты гена 18S рРНК эукариоты приводит к получению смесей продуктов ПЦР. Поскольку все эти ампликоны имеют одинаковую длину, их нельзя отделить друг от друга с помощью электрофореза в агарозном геле. Однако вариации последовательности (то есть различия в содержании и распределении GC) между разными микробными рРНК приводят к разным свойствам денатурации этих молекул ДНК.

Следовательно, модели полос DGGE могут использоваться для визуализации вариаций в генетическом разнообразии микробов и обеспечения приблизительной оценки богатства численности преобладающих членов микробного сообщества. Этот метод часто называют дактилоскопия сообщества. Недавно несколько исследований показали, что DGGE функциональных генов (например, гены, участвующие в восстановлении серы, азотфиксации и окислении аммония) могут одновременно предоставлять информацию о микробной функции и филогении. Например, Tabatabaei et al. (2009) применили DGGE и впервые смогли выявить микробный образец во время анаэробной ферментации сточных вод завода по производству пальмового масла (POME).[9]

использованная литература

  1. ^ Cell. 1979 Янв; 16 (1): 191-200. Независимое от длины разделение рестрикционных фрагментов ДНК в двумерном гель-электрофорезе. Фишер С.Г., Лерман Л.С.
  2. ^ Фишер С. Г. и Лерман Л. С. "Разделение случайных фрагментов ДНК в соответствии со свойствами их последовательностей" Proc. Natl. Акад. Sci. США, 1980, 77, 4420-4424.
  3. ^ Фишер С. Г. и Лерман Л. С. «Фрагменты ДНК, отличающиеся заменами одной пары оснований, разделяются в денатурирующих градиентных гелях: соответствие теории плавления» Proc. Natl. Акад. Sci. США, 1983, 80, 1579-1583.
  4. ^ J Mol Biol. 1994 7 октября; 242 (5): 670-82. Электрофоретическая характеристика денатурированных состояний стафилококковой нуклеазы. Крейтон Т.Э., Шортл Д.
  5. ^ Bioochem. J. (1981) 197, 105-109
  6. ^ а б c d (Биометра, 2000).[нужна цитата ]
  7. ^ (Вонг и др., 2002).[нужна цитата ]
  8. ^ Муйзер Г., де Ваал Э.С., Уиттерлинден АГ. (1993) Профилирование сложных микробных популяций с помощью анализа денатурирующего градиентного гель-электрофореза амплифицированных с помощью полимеразной цепной реакции генов, кодирующих 16S рРНК. Appl Environ Microbiol. 59: 695-700.
  9. ^ DGGE и FISH-анализ метаногенов в закрытом анаэробном резервуаре варочного котла для очистки стоков пальмового завода. Мейсам Табатабаи, Мохд Рафейн Закария, Раха Абдул Рахим, Андре-Денис Г. Райт, Йошихито Шираи, Норхани Абдулла, Кенджи Сакаи, Шинья Икено, Масацугу Мори, Накамура Казунори, Alawi Technology Sulaiman and Mohd Ali Hassan, 2009 Том 12 №3, выпуск от 15 июля 2009 г., ISSN  0717-3458