Микротом - Microtome

Для рода бабочек см. Микротом (моль).

А микротом (от греч. Микрос, что означает "маленький", и Темнеин, что означает «резать») - инструмент, используемый для резать очень тонкие срезы материала, известные как секции. Важное значение в науке, микротомы используются в микроскопия, что позволяет подготовка образцов для наблюдения при переданных свет или же электрон радиация.

В микротомах используются стальные, стеклянные или алмазные лезвия, в зависимости от разрезаемого образца и желаемой толщины разрезаемых частей. Стальные лезвия используются для подготовки срезов тканей животных или растений к световая микроскопия гистология. Стеклянные ножи используются для нарезания срезов для световой микроскопии и для срезания очень тонких срезов для электронная микроскопия. Алмазные ножи промышленного класса используются для резки твердых материалов, таких как кости, зубы и растительный материал, как для световой, так и для электронной микроскопии. Качество драгоценных камней алмазные ножи используются для нарезки тонких срезов для электронная микроскопия.

Микротомия - это метод подготовки тонких срезов таких материалов, как кости, минералы и зубы, и альтернатива электрополировка и ионное измельчение. Срезы микротома можно сделать достаточно тонкими, чтобы разрезать человеческий волос по ширине, при этом толщина среза составляет от 50 до 50.нм и 100мкм.

История

Схема микротома, нарисованная Каммингсом в 1770 году.[1]

В начале оптический микроскоп При разработке срезы растений и животных готовили вручную с помощью бритвенных лезвий. Было обнаружено, что для наблюдения за структурой исследуемого образца важно сделать чистые воспроизводимые срезы размером порядка 100 мкм, через которые может проходить свет. Это позволило наблюдать образцы с помощью световых микроскопов в режиме пропускания.

Одно из первых устройств для приготовления таких нарезок было изобретено в 1770 году Джорджем Адамсом-младшим (1750–1795) и впоследствии развито Александр Каммингс.[2] Устройство приводилось в действие вручную, и образец удерживался в цилиндре, а секции создавались из верхней части образца с помощью рукоятки.[1][3]

В 1835 году Эндрю Причард разработал настольную модель, которая позволяла изолировать вибрацию, прикрепляя устройство к столу, отделяя оператора от ножа.[4]

Иногда авторство изобретения микротома дается анатому. Вильгельм Хис, старший (1865),[5][6]В его Beschreibung eines Mikrotoms (Немецкий для Описание микротома) Вильгельм писал:

Аппарат обеспечил точность в работе, с помощью которой я могу получить секции, которые я не могу создать вручную. А именно это позволило получить в процессе исследования сплошные участки объектов.

Другие источники также приписывают разработку чешскому физиологу. Ян Евангелиста Пуркине.[7] Некоторые источники описывают модель Пуркина как первую в практическом использовании.[8][9]

Неясности в происхождении микротома связаны с тем, что первые микротомы были просто режущими аппаратами, а фаза разработки ранних устройств широко недокументирована.

В конце 1800-х годов разработка очень тонких и неизменно тонких образцов с помощью микротомии вместе с избирательным окрашиванием важных клеточных компонентов или молекул позволила визуализировать детали микроскопа.[10][11]

Сегодня большинство микротомов представляют собой ножевую конструкцию со сменным ножом, держателем образца и механизмом подачи. В большинстве устройств вырезание образца начинается с перемещения образца над ножом, где механизм продвижения автоматически перемещается вперед, так что можно сделать следующий разрез выбранной толщины. Толщина профиля регулируется с помощью механизма регулировки, что позволяет точно регулировать.

Приложения

Микротом (К. Райхерт, Вена, 1905–1915).

Наиболее распространенные применения микротомы находятся:

  • Традиционный Гистология Техника: ткани фиксируются, обезвоживаются, очищаются и заливаются расплавленным материалом. парафин, который при охлаждении образует сплошной блок. Затем ткань разрезается на микротоме толщиной от 2 до 50 мкм. Оттуда ткань может быть помещена на предметное стекло микроскопа, окрашена подходящим водным красителем (ами) после удаления парафина и исследована с помощью светового микроскопа.[12]
  • Процедура замороженного сечения: богатые водой ткани затвердевают путем замораживания и разрезаются в замороженном состоянии с помощью замораживающего микротома или микротома.криостат; срезы окрашивают и исследуют под световым микроскопом. Этот метод намного быстрее традиционной гистологии (5 минут против 16 часов) и используется в сочетании с медицинскими процедурами для быстрой диагностики. Криосрезы также можно использовать в иммуногистохимия поскольку замораживание ткани останавливает деградацию ткани быстрее, чем при использовании фиксатор и не меняет и не маскирует так сильно свой химический состав.
  • Электронная микроскопия Техника: после заливки тканей эпоксидной смолой микротом, оснащенный алмазным ножом для стекла или драгоценных камней, используется для вырезания очень тонких срезов (обычно от 60 до 100 нанометров). Срезы окрашивают водным раствором соответствующей соли тяжелого металла и исследуют с помощью просвечивающий электронный микроскоп. Этот инструмент часто называют ультрамикротом. Ультрамикротом также используется со стеклянным ножом или промышленным алмазным ножом для вырезания геодезических срезов перед тонкими срезами. Эти обзорные срезы обычно имеют толщину от 0,5 до 1 мкм, их помещают на предметное стекло и окрашивают для определения интересующих областей под световым микроскопом до получения тонких срезов для ПЭМ. Нарезка тонких срезов на ПЭМ часто выполняется алмазным ножом ювелирного качества. В дополнение к традиционным методам ПЭМ ультрамикротомы все чаще устанавливаются внутри камеры SEM, поэтому поверхность лицевой стороны блока может быть отображена, а затем удалена с помощью микротома, чтобы открыть следующую поверхность для получения изображения. Эта техника называется Серийная сканирующая электронная микроскопия лица (SBFSEM).
  • Техника ботанической микротомии: для твердых материалов, таких как дерево, кость и кожа, требуется санный микротом. Эти микротомы имеют более тяжелые лезвия и не могут работать так же тонко, как обычный микротом.
  • Спектроскопия (особенно FTIR или же ИК-спектроскопия ) Методика: необходимы тонкие полимерные срезы для того, чтобы инфракрасный луч проник в исследуемый образец. Обычно нарезают образцы толщиной от 20 до 100 мкм. Для более детального анализа гораздо меньших площадей в тонком сечении FTIR микроскопия может использоваться для проверки образцов.

Недавняя разработка - лазерный микротом, который разрезает целевой образец с фемтосекундный лазер вместо механического ножа. Этот метод является бесконтактным и не требует подготовки проб. Лазерный микротом способен разрезать практически любую ткань в ее естественном состоянии. В зависимости от обрабатываемого материала возможна толщина срезов от 10 до 100 мкм.

Интервалы секционирования можно разделить в основном на:

  • Последовательное сечение: получение непрерывной ленты сечений из парафинового блока и использование всего для слайдов.
  • Шаговые секции: собираются на заданной глубине в блоке.

Типы

Санки

Санный микротом

Санный микротом - это устройство, в котором образец помещается в фиксированный держатель (челнок), который затем перемещается вперед и назад по ножу. В современных салазках салазки салазки размещены на линейной опоре, конструкция которой позволяет микротому легко разрезать многие крупные сечения.[13] Регулируя углы между образцом и ножом микротома, можно уменьшить давление, прилагаемое к образцу во время разреза.[13] Типичное применение микротома этой конструкции - приготовление больших образцов, например, залитых в парафин биологических препаратов. Типичная толщина реза, достигаемая на санном микротоме, составляет от 1 до 60 мкм.

Роторный

Ротационный микротом старой конструкции

Этот инструмент представляет собой обычную конструкцию микротома. Это устройство работает с поэтапным вращательным действием, так что фактическая резка является частью вращательного движения. В ротационном микротоме нож обычно фиксируется в горизонтальном положении.[14]

Принцип движения образца для выполнения разреза на роторном микротоме

На рисунке слева поясняется принцип резки. За счет движения держателя образца образец разрезается ножом из положения 1 в положение 2, при этом свежий участок остается на ноже. В самой высокой точке вращательного движения держатель образца продвигается на ту же толщину, что и участок, который должен быть изготовлен, что позволяет сделать следующий участок.

Во многих микротомах маховиком можно управлять вручную. Это имеет то преимущество, что можно сделать чистый разрез, поскольку относительно большая масса маховика предотвращает остановку образца во время разрезания образца. Маховик в новых моделях часто встроен в корпус микротома. Типичная толщина среза вращающегося микротома составляет от 1 до 60 мкм. Для твердых материалов, таких как образец, залитый синтетической смолой, такая конструкция микротома может позволить получить хорошие «полутонкие» срезы толщиной всего 0,5 мкм.

Криомикротом

Смотрите также: Процедура замороженного сечения
Криомикротом

Для резки замороженных образцов многие вращающиеся микротомы могут быть адаптированы для резки в камере с жидким азотом в так называемой установке криомикротома. Пониженная температура позволяет повысить твердость образца, например, за счет стеклования, что позволяет приготовить полутонкие образцы.[13] Однако температуру образца и температуру ножа необходимо контролировать, чтобы оптимизировать получаемую толщину образца.

Ультрамикротом

Лента из ультратонких срезов, приготовленная с помощью ультрамикротомии при комнатной температуре, плавает по воде в лодке алмазного ножа, используемого для разрезания срезов. Лезвие ножа - это край на верхнем конце желоба с водой.

Ультрамикротом - основной инструмент ультрамикротомия. Он позволяет получать очень тонкие срезы, при этом устройство работает так же, как ротационный микротом, но с очень жесткими допусками на механическую конструкцию. В результате тщательной механической конструкции используется линейное тепловое расширение крепления для очень точного контроля толщины.[13]

Эти очень тонкие надрезы важны для использования с просвечивающий электронный микроскоп (ТЕА) и серийная растровая электронная микроскопия (SBFSEM), а также иногда важны для светооптической микроскопии.[14] Типичная толщина этих срезов составляет от 40 до 100 нм для просвечивающей электронной микроскопии и часто от 30 до 50 нм для SBFSEM. Более толстые срезы толщиной до 500 нм также берутся для специализированных приложений ПЭМ или для срезов световой микроскопии, чтобы выбрать область для окончательных тонких срезов. Алмазные ножи (предпочтительно) и стеклянные ножи используются с ультрамикротомами. Чтобы собрать срезы, во время резки их плавают поверх жидкости и осторожно помещают на решетки, подходящие для просмотра образцов ПЭМ. Толщину сечения можно оценить по тонкопленочная интерференция цвета отраженного света, которые видны в результате чрезвычайно малой толщины образца.[15]

Вибрирующий

Основная статья: Вибратом

Вибрационный микротом работает за счет резки с использованием вибрирующего лезвия, что позволяет производить резание с меньшим давлением, чем это требуется для неподвижного лезвия. Вибрационный микротом обычно используется для сложных биологических образцов.[13] Толщина разреза обычно составляет около 30–500 мкм для живой ткани и 10–500 мкм для фиксированной ткани.[16]

Разновидностью вибрирующего микротома является микротом Compresstome.[17] Compresstome использует шприц для образцов или трубку, похожую на губную помаду, чтобы удерживать ткань.[18] Образец ткани полностью погружен в агароза (а полисахарид ), и ткань медленно и осторожно выдавливается из трубки для разреза вибрирующим лезвием. Устройство работает следующим образом: конец трубки с образцом, на котором выходит ткань, немного уже, чем конец нагрузки, что позволяет мягко «сжимать» ткань, когда она выходит из трубки. Небольшое сжатие предотвращает образование артефактов сдвига, неравномерного резания и вибрации. Обратите внимание, что технология сжатия не повреждает и не влияет на разрезаемую ткань.

Микротом Compresstome обладает рядом преимуществ: 1) заделка агарозы обеспечивает стабильность всего образца со всех сторон, что предотвращает неравномерное разрезание или разрез ткани; 2) компрессионная технология мягко сжимает ткань для равномерного разреза, так что лезвие не прижимается к ткани; 3) более быстрое разделение на секции, чем у большинства вибрирующих микротомов; и 4) он хорошо разрезает ткани старых или более взрослых животных, чтобы обеспечить более здоровые ткани.[19]

Увидел

Пильный микротом особенно подходит для твердых материалов, таких как зубы или кости. Микротом этого типа имеет вращающуюся пилу, которая разрезает образец. Минимальная толщина среза составляет примерно 30 мкм и может быть сделана для сравнительно больших образцов.[13]

Лазер

Смотрите также: Лазерный микротом
Концептуальная схема работы лазерного микротома

В лазер микротом - это инструмент для бесконтактной нарезки.[20] Предварительная подготовка образца путем заливки, замораживания или химического фиксация не требуется, что сводит к минимуму артефакты от методов подготовки. В качестве альтернативы эта конструкция микротома также может использоваться для очень твердых материалов, таких как кости или зубы, а также для некоторых керамических изделий. В зависимости от свойств материала образца достижимая толщина составляет от 10 до 100 мкм.

Устройство работает с использованием режущего действия инфракрасного лазера. Поскольку лазер излучает излучение в ближнем инфракрасном диапазоне, в этом режиме длины волны лазер может взаимодействовать с биологическими материалами. Благодаря четкой фокусировке зонда в образце, точка фокусировки очень высокой интенсивности, до TW /см2, может быть достигнут. За счет нелинейного взаимодействия оптического проникновения в фокальной области происходит разделение материала в процессе, известном как фоторазрыв. Ограничивая длительность лазерного импульса фемтосекундным диапазоном, энергия, расходуемая в целевой области, точно регулируется, тем самым ограничивая зону взаимодействия реза до уровня ниже микрометра. За пределами этой зоны ультракороткое время воздействия луча приводит к минимальному тепловому повреждению остальной части образца или его отсутствию.

Лазерное излучение направляется на оптическую систему с быстрым сканированием, основанную на зеркале, которая позволяет трехмерное позиционирование пересечения луча, одновременно обеспечивая прохождение луча в желаемую область интереса. Сочетание высокой мощности с высокой скоростью растрирования позволяет сканеру вырезать большие области образца за короткое время. В лазерном микротоме также возможна лазерная микродиссекция внутренних областей тканей, клеточных структур и других мелких деталей.

Ножи

Лезвие алмазного ножа, используемое для резки ультратонких срезов (обычно от 70 до 350 нм) для просвечивающей электронной микроскопии.
Режущая кромка одноразового лезвия для микротома под микроскопом.

Выбор профиля лезвия ножа микротома зависит от материала и подготовки образцов, а также от требований к конечному образцу (например, толщины и качества среза).

Дизайн и виды кроя

Профили ножей микротома.

Как правило, ножи характеризуются профилем лезвия ножа, который подпадает под категории плоских вогнутых, клиновидных или долотообразных конструкций.

Плоские вогнутые ножи микротома очень острые, но при этом очень хрупкие, поэтому их можно использовать только с очень мягкими образцами.[14] Ножи с клиновым профилем несколько более стабильны и находят применение в материалах средней твердости, таких как эпоксидная смола или криогенная резка образцов. Наконец, профиль долота с его тупым краем повышает устойчивость ножа, при этом требуя значительно большего усилия для достижения резания.

Для ультрамикротомов требуются стеклянные и алмазные ножи, поэтому ширина лезвия составляет порядка нескольких миллиметров и, следовательно, значительно меньше, чем у классических ножей для микротома. Стеклянные ножи обычно изготавливают путем разрушения стеклянных прутков с помощью специальных устройств для разрушения стекла. Стеклянные ножи можно использовать для начальной подготовки проб, даже если алмазные ножи могут использоваться для окончательной резки. Стеклянные ножи обычно имеют небольшие желоба, сделанные из пластиковой ленты, которые заполняются водой, чтобы образец плавал для последующего сбора.[13] Алмазные лезвия могут быть встроены в такой существующий желоб, что позволяет использовать тот же метод сбора.

Разделение

Перед разрезанием микротомом биологические материалы обычно помещаются в более жесткий фиксатор в процессе, известном как заливка. Это достигается за счет притока жидкого вещества вокруг образца, такого как парафин (воск) или эпоксидная смола, который помещается в форму и затем затвердевает с образованием «блока», который легко разрезается.

Наклонение - это угол контакта между вертикалью образца и лезвием ножа. Если лезвие ножа расположено под прямым углом (наклон = 90), разрез выполняется непосредственно с использованием режима, основанного на давлении, и поэтому силы пропорционально больше. Однако, если нож наклонен, относительное движение ножа становится все более параллельным движению образца, что обеспечивает возможность разрезания. Такое поведение очень важно для больших или твердых образцов.

Наклон ножа - это угол между лицевой стороной ножа и образцом. Для получения оптимального результата этот угол нужно выбирать соответствующим образом. Оптимальный угол зависит от геометрии ножа, скорости резки и многих других параметров. Если угол отрегулирован до нуля, резание ножом часто может стать беспорядочным, и необходимо использовать новое положение ножа, чтобы сгладить это.

Если угол слишком большой, образец может смяться, и нож может вызвать периодические изменения толщины среза. При дальнейшем увеличении угла до слишком большого можно повредить лезвие ножа.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Хилл, Джон (1770). Строительство из древесины с самого начала; Разъяснено под микроскопом и подтверждено экспериментами в большом разнообразии видов. Лондон: Автор. стр.5 –11, табл. I.
  2. ^ Квекетт, Джон (1848). Практическое руководство по использованию микроскопа. Лондон: Ипполит Байер. стр.306, Глава XII (Микротомы и ножи микротомов).
  3. ^ Анонимный (1910). «Микротом восемнадцатого века». Журнал Королевского микроскопического общества. Оксфорд, Англия: Королевское микроскопическое общество: 779–782.
  4. ^ Гилберт Морган Смит: Развитие ботанической микротехники. В: Труды Американского микроскопического общества 34, № 2. 1915 г., С. 71–129, (PDF-версия статьи) JSTOR  3221940 Дои:10.2307/3221940 Бесплатно читать
  5. ^ "Вильгельм Хис". Энциклопедия Britannica Online. Британская энциклопедия. Получено 24 марта 2009.
  6. ^ Лукас М., Кларк П., Таббс Р.С., Капош Т., Троц М. (2008). «Его семья и их вклад в кардиологию». Международный журнал кардиологии. 123 (2): 75–78. Дои:10.1016 / j.ijcard.2006.12.070. ISSN  0167-5273. PMID  17433467.
  7. ^ «Гистология». msn Encarta. Архивировано из оригинал 25 апреля 2009 г.. Получено 18 марта 2009.
  8. ^ Детлев Гантен: Handbuch der Molekularen Medizin (Справочник по молекулярной медицине), Спрингер, ISBN  3-540-64552-7, (Google-Книги )
  9. ^ Вернер Герабек, Бернхард Д. Хааге, Гундольф Кейл, Вольфганг Вегнер (2005): Enzyklopädie Medizingeschichte (Энциклопедия истории болезни), Вальтер де Грюйтер, ISBN  3-11-015714-4, (Google-Книги )
  10. ^ Эрнст Майр (2002). Die Entwicklung der biologischen Gedankenwelt. (Эволюция биологической мысли). Springer. ISBN  978-3-540-43213-5.
  11. ^ Вернер Линс, Вернер Линб, Йохен Фанганель: Гистология: Zytologie, allgemeine Histologie, mikroskopische Anatomie. (Гистология: цитология, общая гистология, микроскопическая анатомия) Walter de Gruyter, 1998, ISBN  3-11-014032-2 (Google-Книги )
  12. ^ Бэнкрофт, Джон; Стивенс, Алан, ред. (1982). Теория и практика гистологических методов (2-е изд.). Longman Group Limited.
  13. ^ а б c d е ж грамм Гудрун Ланг (2006). Histotechnik. Praxislehrbuch für die Biomedizinische Analytik. (Гистология: практическое пособие по аналитической биомедицине). Спрингер, Вена / Нью-Йорк. ISBN  978-3-211-33141-5.
  14. ^ а б c Клаус Хенкель: Das Schneiden mit dem Mikrotom В архиве 10 ноября 2009 г. Wayback Machine. Mikrobiologische Vereinigung München e. V., 2006, по состоянию на 15 февраля 2009 г.
  15. ^ Пичи Ли Д. (1958). «Тонкие срезы: исследование толщины срезов и физических искажений, возникающих во время микротомии» (PDF). J Biophys Biochem Cytol. 4 (3): 233–242. Дои:10.1083 / jcb.4.3.233. ЧВК  2224471. PMID  13549493.
  16. ^ Крамдик, Карлос Л. (январь 2013 г.). «Создание микротома из живых тканей: размышления машиниста-любителя». Ксенобиотика. 43 (1): 2–7. Дои:10.3109/00498254.2012.724727. ISSN  0049-8254.
  17. ^ Abdelaal, Hadia M .; Kim, Hyeon O .; Вагстафф, Рис; Савахата, Рёко; Южный, Питер Дж .; Скиннер, Памела Дж. (1 января 2015 г.). «Сравнение срезов с использованием вибратома и компресстома свежих лимфоидных и генитальных тканей приматов для in situ MHC-тетрамера и иммунофлуоресцентного окрашивания». Биологические процедуры онлайн. 17 (1): 2. Дои:10.1186 / s12575-014-0012-4. ISSN  1480-9222. ЧВК  4318225. PMID  25657614.
  18. ^ "индекс". www.precisionary.com. Получено 6 сентября 2016.
  19. ^ «Улучшенные методы получения острых срезов головного мозга взрослых и стареющих животных».
  20. ^ Хольгер Любачовски 2007: Лазерная микротомия, WILEY-VCH Verlag GmbH, Biophotonics, S. 49–51 (PDF В архиве 19 июля 2011 г. Wayback Machine ). Дои:10.1002 / opph.201190252 Бесплатно читать

внешняя ссылка