Фёрстеровский резонансный перенос энергии - Förster resonance energy transfer

Диаграмма Яблонского FRET с указанием типичных сроков. Обратите внимание, что черная пунктирная линия указывает на виртуальный фотон.

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET), флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET), резонансная передача энергии (RET) или электронная передача энергии (восточноевропейское время) - механизм, описывающий передачу энергии между двумя светочувствительными молекулами (хромофоры ).^[1] Донорный хромофор, первоначально находящийся в возбужденном электронном состоянии, может передавать энергию акцепторному хромофору посредством безызлучательного диполь-дипольная связь.^[2] Эффективность этой передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором, что делает FRET чрезвычайно чувствительным к небольшим изменениям расстояния.^[3]

Измерения эффективности FRET можно использовать, чтобы определить, флуорофоры находятся на определенном расстоянии друг от друга.^[4] Такие измерения используются в качестве инструмента исследования в таких областях, как биология и химия.

FRET аналогичен ближнее поле коммуникации, в том, что радиус взаимодействия намного меньше, чем длина волны излучаемого света. В ближней области возбужденный хромофор излучает виртуальный фотон что мгновенно поглощается получающим хромофором. Эти виртуальные фотоны невозможно обнаружить, поскольку их существование нарушает закон сохранения энергии и импульса, и поэтому FRET известен как безызлучательный механизм. Квантовая электродинамика расчеты были использованы для определения безызлучательной (FRET) и радиационная передача энергии бывают ближнего и дальнего действия асимптоты единого унифицированного механизма.^[5][6][7]

Терминология

Мультяшная диаграмма концепции резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET).

Фёрстеровский резонансный перенос энергии назван в честь немецкого ученого. Теодор Ферстер.^[8] Когда оба хромофора являются флуоресцентными, вместо этого часто используется термин «резонансный перенос энергии флуоресценции», хотя на самом деле энергия не передается посредством флуоресценция.^[9][10] Чтобы избежать ошибочной интерпретации явления, которое всегда представляет собой безызлучательный перенос энергии (даже если он происходит между двумя флуоресцентными хромофорами), название «резонансный перенос энергии Фёрстера» предпочтительнее, чем «резонансный перенос энергии флуоресценции»; однако последний широко используется в научной литературе.^[11] FRET не ограничивается флуоресценцией и также возникает в связи с фосфоресценцией.^[9]

Теоретические основы

Эффективность FRET (${ displaystyle E}$) это квантовый выход перехода с передачей энергии, то есть вероятность возникновения события передачи энергии в расчете на одно событие возбуждения донора:^[12]

${ displaystyle E = { frac {k _ { text {ET}}} {k_ {f} + k _ { text {ET}} + sum {k_ {i}}}},}$

куда ${ displaystyle k _ { text {ET}}}$ скорость передачи энергии, ${ displaystyle k_ {f}}$ скорость радиационного распада донора, и ${ displaystyle k_ {i}}$ скорости любых других путей девозбуждения, исключая передачу энергии другим акцепторам.^[13][14]

Эффективность FRET зависит от многих физических параметров, которые можно сгруппировать как: 1) расстояние между донором и акцептором (обычно в диапазоне 1–10 нм), 2) спектральное перекрытие донора. спектр излучения и акцептор спектр поглощения и 3) взаимная ориентация донорного излучения дипольный момент и дипольный момент поглощения акцептора.

${ displaystyle E}$ зависит от расстояния от донора до акцептора ${ displaystyle r}$ с обратным законом 6-й степени за счет диполь-дипольного механизма связи:

${ displaystyle E = { frac {1} {1+ (r / R_ {0}) ^ {6}}}}$

с ${ displaystyle R_ {0}}$ расстояние Ферстера этой пары донора и акцептора, то есть расстояние, на котором эффективность передачи энергии составляет 50%.^[13]Расстояние Фёрстера зависит от перекрытия интеграл спектра излучения доноров со спектром поглощения акцепторов и их взаимной молекулярной ориентацией, выраженной следующим уравнением:^[15][16][17]

${ displaystyle {R_ {0}} ^ {6} = { frac {2.07} {128 , pi ^ {5} , N_ {A}}} , { frac { kappa ^ {2} , Q_ {D}} {n ^ {4}}} { int F _ { rm {D}} ( lambda) , epsilon _ { rm {A}} ( lambda) , lambda ^ {4} , d lambda}}$

куда ${ displaystyle Q _ { text {D}}}$ флуоресценция квантовый выход донора в отсутствие акцептора, ${ displaystyle kappa ^ {2}}$ - фактор ориентации диполя, ${ displaystyle n}$ это показатель преломления среды, ${ displaystyle N _ { text {A}}}$ это Константа Авогадро, и ${ displaystyle J}$ - интеграл спектрального перекрытия, вычисляемый как

${ displaystyle J = { frac { int f _ { text {D}} ( lambda) epsilon _ { text {A}} ( lambda) lambda ^ {4} , d lambda} { int f _ { text {D}} ( lambda) , d lambda}} = int { overline {f _ { text {D}}}} ( lambda) epsilon _ { text {A }} ( lambda) lambda ^ {4} , d lambda,}$

куда ${ displaystyle f _ { text {D}}}$ - спектр излучения донора, ${ Displaystyle { overline {е _ { текст {D}}}}}$ - спектр излучения донора, нормированный на площадь 1, и ${ displaystyle epsilon _ { text {A}}}$ акцептор молярный коэффициент экстинкции, обычно получается из спектра поглощения.^[18]Фактор ориентации κ дан кем-то

${ displaystyle kappa = { hat { mu}} _ { text {A}} cdot { hat { mu}} _ { text {D}} - 3 ({ hat { mu} } _ { text {D}} cdot { hat {R}}) ({ hat { mu}} _ { text {A}} cdot { hat {R}}),}$

куда ${ displaystyle { hat { mu}} _ {i}}$ обозначает нормированный дипольный момент перехода соответствующего флуорофора, а ${ displaystyle { hat {R}}}$ обозначает нормализованное смещение между флуорофорами.${ displaystyle kappa ^ {2}}$ = 2/3 часто предполагается. Это значение получается, когда оба красителя свободно вращаются, и его можно рассматривать как изотропно ориентированные в течение времени жизни в возбужденном состоянии. Если какой-либо краситель закреплен или не может вращаться, то ${ displaystyle kappa ^ {2}}$ = 2/3 не будет верным предположением. В большинстве случаев, однако, даже небольшая переориентация красителей приводит к достаточному ориентационному усреднению, чтобы ${ displaystyle kappa ^ {2}}$ = 2/3 не приводит к большой ошибке в оценке расстояния передачи энергии из-за шестой степени зависимости ${ displaystyle R_ {0}}$ на ${ displaystyle kappa ^ {2}}$. Даже когда ${ displaystyle kappa ^ {2}}$ сильно отличается от 2/3, ошибка может быть связана со смещением ${ displaystyle R_ {0}}$, и, таким образом, определения изменений относительного расстояния для конкретной системы все еще действительны. Флуоресцентные белки не переориентируются во времени, превышающем время их флуоресценции. В этом случае 0 ≤ ${ displaystyle kappa ^ {2}}$ ≤ 4.^[18]

Для зависимого от времени анализа FRET скорость передачи энергии (${ displaystyle k _ { text {ET}}}$) можно использовать напрямую вместо:^[15]

${ displaystyle k _ { text {ET}} = ({ frac {R_ {0}} {r}}) ^ {6} , { frac {1} { tau _ {D}}}}$

куда ${ displaystyle tau _ {D}}$ - время жизни флуоресценции донора в отсутствие акцептора.

Эффективность FRET связана с квантовым выходом и временем жизни флуоресценции донорной молекулы следующим образом:^[19]

${ displaystyle E = 1- tau '_ { text {D}} / tau _ { text {D}},}$

куда ${ Displaystyle тау _ { текст {D}} '}$ и ${ Displaystyle тау _ { текст {D}}}$ - времена жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора соответственно, или как

${ displaystyle E = 1-F _ { text {D}} '/ F _ { text {D}},}$

куда ${ displaystyle F _ { text {D}} '}$ и ${ displaystyle F _ { text {D}}}$ - интенсивности флуоресценции донора с акцептором и без акцептора соответственно.

Экспериментальное подтверждение теории резонансного переноса энергии Фёрстера

Обратная зависимость ферстеровского резонансного переноса энергии от расстояния в шестой степени была экспериментально подтверждена Вилчек, Эдельхох и Бренд^[20] с использованием триптофильных пептидов. Страйер, Haugland и Игерабиде^{[21][нужна цитата ] [22]} также экспериментально продемонстрирована теоретическая зависимость резонансной передачи энергии Фёрстера от интеграла перекрытия с использованием конденсированного индолостероида в качестве донора и кетона в качестве акцептора. Однако было обнаружено множество противоречий специальных экспериментов с теорией. Причина в том, что теория носит приблизительный характер и дает завышенные расстояния в 50–100 Ангстремов.^[23]

Методы измерения эффективности FRET

Во флюоресценции микроскопия, флуоресценция конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, а также в молекулярная биология, FRET - полезный инструмент для количественной оценки молекулярной динамики в биофизика и биохимия, Такие как белок -белковые взаимодействия, белок–ДНК взаимодействия и конформационные изменения белков. Для наблюдения за образованием комплекса между двумя молекулами одна из них помечена донором, а другая - акцептором. Эффективность FRET измеряется и используется для идентификации взаимодействий между мечеными комплексами. Существует несколько способов измерения эффективности FRET путем отслеживания изменений флуоресценции, испускаемой донором или акцептором.^[24]

Сенсибилизированное излучение

Одним из методов измерения эффективности FRET является измерение изменения интенсивности излучения акцептора.^[16] Когда донор и акцептор находятся рядом (1–10 нм) из-за взаимодействия двух молекул, эмиссия акцептора будет увеличиваться из-за межмолекулярный FRET от донора к акцептору. Для мониторинга конформационных изменений белка целевой белок помечают донором и акцептором в двух локусах. Когда поворот или изгиб белка приводит к изменению расстояния или относительной ориентации донора и акцептора, наблюдается изменение FRET. Если молекулярное взаимодействие или изменение конформации белка зависит от лиганд связывания, этот метод FRET применим к флуоресцентным индикаторам для обнаружения лиганда.

Фотообесцвечивание FRET

Об эффективности FRET также можно судить по фотообесцвечивание ставки донора в присутствии и в отсутствие акцептора.^[16] Этот метод можно использовать на большинстве флуоресцентных микроскопов; один просто направляет возбуждающий свет (с частотой, которая будет возбуждать донор, но не акцептор в значительной степени) на образцы с акцепторным флуорофором и без него и контролирует флуоресценцию донора (обычно отделенную от флуоресценции акцептора с помощью полосовой фильтр ) через некоторое время. Шкала времени соответствует фотообесцвечиванию, от секунд до минут, при этом флуоресценция на каждой кривой определяется выражением

${ displaystyle { text {background}} + { text {constant}} cdot e ^ {- { text {time}} / tau _ { text {pb}}},}$

куда ${ displaystyle tau _ { text {pb}}}$ - постоянная времени затухания фотообесцвечивания и зависит от того, присутствует акцептор или нет. Поскольку фотообесцвечивание заключается в постоянной инактивации возбужденных флуорофоров, резонансная передача энергии от возбужденного донора к акцепторному флуорофору предотвращает фотообесцвечивание этого донорного флуорофора, и, таким образом, высокая эффективность FRET приводит к более длительной постоянной времени затухания фотообесцвечивания:

${ displaystyle E = 1- tau _ { text {pb}} / tau _ { text {pb}} ',}$

куда ${ displaystyle tau _ { text {pb}} '}$ и ${ displaystyle tau _ { text {pb}}}$ - постоянные времени затухания фотообесцвечивания донора в присутствии и в отсутствие акцептора соответственно. (Обратите внимание, что эта дробь является обратной величиной, используемой для измерения срока службы).

Этот метод был введен Джовином в 1989 году.^[25] Использование всей кривой точек для извлечения постоянных времени может дать ему преимущество в точности по сравнению с другими методами. Кроме того, тот факт, что измерения времени выполняются в течение нескольких секунд, а не наносекунд, упрощает измерение времени жизни флуоресценции, а поскольку скорость затухания фотообесцвечивания обычно не зависит от концентрации донора (если не возникает проблемы насыщения акцептора), тщательный контроль концентраций необходим для оценки интенсивности замеры не нужны. Однако важно поддерживать одинаковую освещенность для измерений без акцептора и без акцептора, поскольку фотообесцвечивание заметно усиливается при более интенсивном падающем свете.

Измерения срока службы

Эффективность FRET также можно определить по изменению флуоресценции. продолжительность жизни донора.^[16] Время жизни донора будет уменьшаться в присутствии акцептора. Измерения времени жизни FRET-донора используются в микроскопия для визуализации флуоресценции (FLIM).

Флуорофоры, используемые для FRET

Если линкер не поврежден, возбуждение на длине волны поглощения CFP (414 нм) вызывает излучение YFP ​​(525 нм) из-за FRET. Если линкер расщепляется протеазой, FRET отменяется и излучение происходит на длине волны CFP (475 нм).

Пары CFP-YFP

Одна из распространенных пар флуорофоров для биологического использования - это голубой флуоресцентный белок (CFP) - желтый флуоресцентный белок (YFP) пара.^[26] Оба варианта цвета зеленый флуоресцентный белок (GFP). Мечение органическими флуоресцентными красителями требует очистки, химической модификации и внутриклеточной инъекции белка-хозяина. Варианты GFP могут быть прикреплены к белку-хозяину с помощью генная инженерия что может быть удобнее. Кроме того, слияние CFP и YFP («тандем-димер»), связанных посредством протеаза последовательность расщепления можно использовать в качестве анализа расщепления.^[27]

BRET

Ограничением FRET, выполняемого с донорами флуорофора, является требование внешнего освещения для инициирования передачи флуоресценции, что может привести к фоновому шуму в результате прямого возбуждения акцептора или к фотообесцвечивание. Чтобы избежать этого недостатка, биолюминесценция резонансная передача энергии (или BRET) была разработана.^[28][29] В этой технике используется биолюминесцентный люцифераза (обычно люцифераза из Renilla reniformis ), а не CFP, чтобы произвести начальное излучение фотонов, совместимое с YFP.

BRET также был реализован с использованием другого фермента люциферазы, созданного из глубоководных креветок. Oplophorus gracilirostris. Эта люцифераза меньше (19 кДа) и ярче, чем более широко используемая люцифераза из Renilla reniformis.^{[30][31][32][33]} Промега разработала этот вариант люциферазы под названием NanoLuc.^[34]

Homo-FRET

В общем, «FRET» относится к ситуациям, когда донорные и акцепторные белки (или «флуорофоры») относятся к двум различным типам. Однако во многих биологических ситуациях исследователям может потребоваться изучить взаимодействия между двумя или более белками одного и того же типа - или действительно одним и тем же белком с самим собой, например, если белок сворачивается или образует часть полимерной цепи белков.^[35] или по другим вопросам количественной оценки биологических клеток.^[36]

Очевидно, спектральные различия не будут инструментом, используемым для обнаружения и измерения FRET, поскольку и акцепторный, и донорный белок излучают свет с одинаковыми длинами волн. Тем не менее, исследователи могут обнаруживать различия в поляризации между светом, который возбуждает флуорофоры, и светом, который излучается, с помощью метода, называемого визуализацией анизотропии FRET; уровень количественной анизотропии (разница в поляризации между возбуждающим и испускаемым пучками) становится индикатором того, сколько событий FRET произошло.^[37]

Другие

Различные соединения помимо флуоресцентных белков.^[38]

Приложения

Применение флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) значительно расширилось за последние 25 лет, и этот метод стал основным во многих биологических и биологических исследованиях. биофизический поля. FRET можно использовать в качестве спектроскопической линейки для измерения расстояния и обнаружения молекулярных взаимодействий в ряде систем и находит применение в биологии и биохимии.^[22]

Белки

FRET часто используется для обнаружения и отслеживания взаимодействий между белками.^{[39][40][41][42]} Кроме того, FRET можно использовать для измерения расстояний между домены в одном белке, помечая различные области белка флуорофором и измеряя эмиссию для определения расстояния. Это предоставляет информацию о конформация белка, включая второстепенные конструкции и сворачивание белка.^[43][44] Это распространяется на отслеживание функциональных изменений в структуре белка, таких как конформационные изменения, связанные с миозин Мероприятия.^[45] Применяемый in vivo, FRET использовался для определения местоположения и взаимодействия клеточных структур, включая интегрины и мембранные белки.^[46]

Мембраны

FRET можно использовать для наблюдения текучесть мембраны, движение и рассредоточение мембранных белков, липид-белковые и белок-белковые взаимодействия мембран, а также успешное смешивание различных мембран.^[47] FRET также используется для изучения образования и свойств мембранных доменов и липидные рафты в клеточные мембраны^[48] и для определения поверхностной плотности мембран.^[49]

Хемосенсор

Зонд на основе FRET, который активируется при взаимодействии с Cd2 +

Зонды на основе FRET могут обнаруживать присутствие различных молекул: на структуру зонда влияет связывание или активность небольших молекул, которые могут включать или выключать систему FRET. Это часто используется для обнаружения анионов, катионов, небольших незаряженных молекул, а также некоторых более крупных биомакромолекул. Аналогичным образом, системы FRET были разработаны для обнаружения изменений в сотовой среде из-за таких факторов, как pH, гипоксия, или митохондриальный мембранный потенциал.^[50]

Сигнальные пути

Еще одно применение FRET - изучение метаболизма или сигнальные пути.^[51] Например, FRET и BRET использовались в различных экспериментах для характеристики Рецептор, связанный с G-белком активация и последующие сигнальные механизмы.^[52] Другие примеры включают использование FRET для анализа таких разнообразных процессов, как бактериальный хемотаксис^[53] и каспаза деятельность в апоптоз.^[54]

Другие приложения

Помимо обычных применений, упомянутых ранее, FRET и BRET также эффективны при изучении кинетики биохимических реакций.^[55] FRET все чаще используется для контроля за сборкой и разборкой в ​​зависимости от pH и является ценным при анализе нуклеиновые кислоты.^{[56][57][58][59]} Этот метод можно использовать для определения факторов, влияющих на различные типы наночастица формирование^[60][61] а также механизмы и эффекты наномедицины.^[62]

Другие методы

Другой, но связанный механизм Перенос электронов по Декстеру.

Альтернативным методом определения белок-белковой близости является бимолекулярная комплементация флуоресценции (BiFC), где две части флуоресцентного белка слиты с другими белками. Когда эти две части встречаются, они образуют флуорофор на временной шкале в минутах или часах.^[63]

Смотрите также

• Перенос электронов по Декстеру
• Муфта Förster
• Передача поверхностной энергии
• Передача энергии флуоресценции с временным разрешением

Рекомендации

внешняя ссылка

• Эффект FRET в тонкой пленке на YouTube
• FRET Imaging (Учебник Becker & Hickl, веб-сайт)