MCherry - Википедия - mCherry

мЧерри является членом семейства мономерных красных флуоресцентных белков (mRFP) mFruits. В качестве RFP mCherry был получен из DsRed из Дискосома морские анемоны в отличие от зеленые флуоресцентные белки (GFP), которые часто получаются из Aequoera victoria медузы.[1] Флуоресцентные белки используются для маркировки компонентов в клетке, поэтому их можно изучать с помощью флуоресцентная спектроскопия и флуоресцентная микроскопия. mCherry поглощает свет в диапазоне 540-590 нм и излучает свет в диапазоне 550-650 нм.[2] mCherry относится к группе флуоресцентных белков хромофоры используются в качестве инструментов для визуализации генов и анализа их функций в экспериментах. Редактирование генома был значительно улучшен за счет точной вставки этих флуоресцентных белковых меток в генетический материал многих разнообразных организмов. Было проведено большинство сравнений яркости и фотостабильности различных флуоресцентных белков. in vitro, удалены из биологических переменных, которые влияют на производительность белка в клетках или организмах.[3] Трудно точно смоделировать клеточную среду in vitro, и разница в окружающей среде может повлиять на яркость и фотостабильность.

mRFP, такие как mCherry, полезны, потому что они имеют более низкую молекулярную массу и будут складываться быстрее, чем тетрамеры. Это приводит к тому, что мономерные флуоресцентные белки меньше беспокоят систему-мишень.

Разработка

DsRed изолирован от Дискосома морских анемонов, и это тетрамерный белок.[1] Большинство красных флуоресцентных белков поступает из DsRed. DsRed имеет низкую фотостабильность (устойчивость к изменениям под действием лучистой энергии или света) и медленную скорость созревания (время до свертывания половины белка). mRFP1 происходит от DsRed и является мономер поэтому он меньше, но его квантовый выход и фотостабильность меньше, чем у DsRed.[1] mCherry и другие mFruits имеют улучшенную яркость и фотостабильность по сравнению с DsRed и mRFP1. mCherry был разработан с помощью направленная эволюция из mRFP1 Роберта Э. Кэмпбелла.[1] В целом mFruits были разработаны, потому что, хотя белки разного цвета можно было найти из других антозои, белки в основном будут тетрамерами, которые, скорее всего, будут иметь те же проблемы, что и DsRed. Эти тетрамеры потребуют дериваций, подобных тем, которые были сделаны для DsRed, чтобы сделать их полезными партнерами по слиянию.[1] В результате mFruits были получены из mRFP1 путем корректировки ключевых аминокислот для корректировки длин волн возбуждения и излучения. Разные цвета позволяют отслеживать разные типы клеток, транскрипционную активность и слияние белков. mCherry, из всех разработанных истинных мономеров, имеет самую длинную длину волны, самую высокую фотостабильность, самое быстрое созревание, отличную устойчивость к pH и наиболее близок к mRFP1 по максимумам возбуждения и испускания.[1] Однако mCherry имеет более низкую квантовый выход чем mRFP1.[1]

Белковый состав mCherry. Идентификатор PDB: 2H5Q

Структура

Ген mCherry имеет длину 711 пар оснований,[4] и белок состоит из 236 остатков с массой 26,722 кДа.[5] Кристаллическая структура mCherry была определена в 2006 году.[6] Он содержит 3 альфа спирали и 13 бета-листы которые составляют бета-баррель. Хромофор в mCherry состоит из трех аминокислот: глутамин, тирозин, и глицин, которые посттрансляционно модифицируются в имидазолинон.[1] Количество этих остатков в последовательности составляет 66, 67 и 68 соответственно. Расширенная конъюгация пи-электронов дает mCherry ее поглощение и излучение с красным смещением.[7] Хромофор формируется из центральной спирали, которая защищена от растворителя в 11-нитевом бета-цилиндре.[7] Эта структура почти идентична третичной структуре DsRed, которая также имеет 11-нитевой бета-цилиндр, и аналогична третичной структуре GFP.[8] Это делает среду вокруг хромофора в mCherry более гидрофобной, чем среду вокруг хромофора DsRed.[9] Конечные окончания mCherry похожи на GFP, что позволяет встраивать его в системы, в которых можно использовать GFP, а mRFP1 использовать нельзя.[1]

Использует

mCherry используется во флуоресцентной микроскопии в качестве внутриклеточного зонда.[10] Однако, когда белок маркируется путем слияния с флуоресцентным белком, взаимодействия между ними могут нежелательно нарушать нацеливание или функцию.[11]

mCherry ценится там, где желательна конститутивная экспрессия генов, а другие экспериментальные подходы требуют скоординированного контроля нескольких генов. Хотя для использования в E. кишечная палочка и других моделей, полезность и функциональность таких методов не всегда переносятся на другие виды. Например, для Грамотрицательный возбудитель, Легионелла пневмофила, вектор для Болезнь легионеров, Ptac system представляет собой единственную хорошо отлаженную систему контроля экспрессии. Чтобы расширить инструменты, доступные для изучения экспрессии бактериальных генов в L. пневмофилаБыл разработан mCherry, который обеспечивает конститутивную экспрессию гена из мутагенизированного сайта связывания LacI. mCherry не взаимодействует с другими плазмидами, содержащими интактный LacI-Ptac система экспрессии и не влияет на рост Легионелла виды во время внутриклеточного роста. Плазмидный каркас mCherry с широким спектром хозяев обеспечивает конститутивную экспрессию генов у самых разных видов грамотрицательных бактерий, что делает mCherry полезным инструментом для более широкого исследовательского сообщества.[12]

Его также можно использовать в качестве длинноволнового гетеро-FRET (резонансного переноса энергии флуоресценции) акцептора и зонда для экспериментов с гомо-FRET.[13] FRET - это тип передачи энергии флуоресценции, при котором нет промежуточного фотона, а энергия передается от донора к акцептору. А также может использоваться для маркировки бактерий, чтобы визуализировать их без давления антибиотиков.[14]

Другие RFP и mFruits

Исходный запрос предложения: DsRed

Запрос предложений первого поколения: mRFP1

RFP второго поколения: mStrawberry, mOrange, dTomato

mFruit - это мономерные красные флуоресцентные белки (mRFP) второго поколения, которые имеют улучшенную яркость и фотостабильность по сравнению с mRFP1 первого поколения. Их длины волн излучения и возбуждения распределены в диапазоне примерно 550-650 и 540-590 нм соответственно. Однако различия в их спектрах можно проследить до нескольких ключевых аминокислот. Кристаллографический анализ спектроскопии и атомного разрешения трех представителей, mOrange, mStrawberry и mCherry, показывает, что для установления максимумов возбуждения и излучения действуют разные механизмы. Пройдя вторую стадию окисления, каждый mFruit продуцирует ацилиминную связь в основной цепи полипептида. По сравнению с предшественником DsRed, прямая ковалентная модификация этой связи (mOrange) и непрямая модификация хромофорной среды (mStrawberry и mCherry) дает варианты с сильным смещением в синий и красный цвета. Голубой сдвиг mOrange вызывается ковалентной модификацией его белковой цепи.

Карта электронной плотности указывает на образование третьего гетероцикла, 2-гидрокси-дигидрооксазола, в результате реакции Thr 66 Oγ с основной цепью полипептида, что, в свою очередь, снижает конъюгацию карбонила в положении 65 с остальной частью хромофора. В mStrawberry и mCherry движение заряженного Lys 70 и протонирование Glu 215, как предполагается, изменяют распределение электронной плотности хромофора, вызывая их характерное красное смещение.[2]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я Шэнер, Натан С; Кэмпбелл, Роберт Э; Steinbach, Paul A; Гипманс, Бен Н.Г .; Палмер, Эми Э; Цзянь, Роджер Y (2004-11-21). «Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из красного флуоресцентного белка Discosoma sp.». Природа Биотехнологии. 22 (12): 1567–1572. Дои:10.1038 / nbt1037. ISSN  1087-0156. PMID  15558047. S2CID  205272166.
  2. ^ а б Шу, Сяокунь; Shaner, Натан C .; Ярбро, Корин А .; Tsien, Roger Y .; Ремингтон, С. Джеймс (август 2006 г.). "Новые хромофоры и скрытые заряды контроля цвета в mFruits †, ‡". Биохимия. 45 (32): 9639–9647. Дои:10.1021 / bi060773l. ISSN  0006-2960. PMID  16893165.
  3. ^ Heppert, Jennifer K .; Дикинсон, Дэниел Дж .; Пани, Ариэль М .; Хиггинс, Кристофер Д.; Стюард, Аннетт; Аринджер, Джули; Kuhn, Jeffrey R .; Гольдштейн, Боб (07.11.2016). «Сравнительная оценка флуоресцентных белков для визуализации in vivo в модельной системе на животных». Молекулярная биология клетки. 27 (22): 3385–3394. Дои:10.1091 / mbc.e16-01-0063. ISSN  1059-1524. ЧВК  5221575. PMID  27385332.
  4. ^ «Addgene - Анализировать последовательность». www.addgene.org. Получено 2018-11-11.
  5. ^ «mCherry - флуоресцентный белок MCherry - Anaplasma marginale - ген и белок mCherry». www.uniprot.org. Получено 2018-11-11.
  6. ^ Шу, X .; Ремингтон, С.Дж. (2006-08-22). «Кристаллическая структура мЧерри». www.rcsb.org. Дои:10.2210 / pdb2h5q / pdb. Получено 2018-11-11.
  7. ^ а б Мияваки, Ацуши; Щербакова, Дарья М; Верхуша, Владислав В (октябрь 2012). «Красные флуоресцентные белки: образование хромофоров и клеточные применения». Текущее мнение в структурной биологии. 22 (5): 679–688. Дои:10.1016 / j.sbi.2012.09.002. ISSN  0959-440X. ЧВК  3737244. PMID  23000031.
  8. ^ "Интернет-кампус ZEISS Microscopy | Флуоресцентные белки Anthozoa". zeiss-campus.magnet.fsu.edu. Получено 2018-11-15.
  9. ^ Субач, Федор В .; Верхуша, Владислав В. (2012-07-11). «Хромофорные превращения в красных флуоресцентных белках». Химические обзоры. 112 (7): 4308–4327. Дои:10.1021 / cr2001965. ISSN  0009-2665. ЧВК  3394910. PMID  22559232.
  10. ^ Субач, Федор В; Паттерсон, Джордж H; Мэнли, Сулиана; Gillette, Jennifer M; Липпинкотт-Шварц, Дженнифер; Верхуша, Владислав В (25.01.2009). «Фотоактивируемый mCherry для двухцветной флуоресцентной микроскопии высокого разрешения». Методы природы. 6 (2): 153–159. Дои:10.1038 / nmeth.1298. ISSN  1548-7091. ЧВК  2901231. PMID  19169259.
  11. ^ Шэнер, Натан С; Кэмпбелл, Роберт Э; Steinbach, Paul A; Гипманс, Бен Н.Г .; Палмер, Эми Э; Цзянь, Роджер Y (2004-11-21). «Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из красного флуоресцентного белка Discosoma sp.». Природа Биотехнологии. 22 (12): 1567–1572. Дои:10.1038 / nbt1037. ISSN  1087-0156. PMID  15558047. S2CID  205272166.
  12. ^ Гебхардт, Майкл Дж .; Джейкобсон, Рэйчел К .; Шуман, Ховард А. (2017-03-03). «Видение красного; развитие pON.mCherry, плазмиды конститутивной экспрессии с широким спектром хозяев для грамотрицательных бактерий». PLOS ONE. 12 (3): e0173116. Дои:10.1371 / journal.pone.0173116. ISSN  1932-6203. ЧВК  5336243. PMID  28257493.
  13. ^ Акрап, Нина; Зайдель, Торстен; Барисас, Б. Джордж (июль 2010 г.). «Расстояния Ферстера для резонансной передачи энергии флуоресценции между mCherry и другими видимыми флуоресцентными белками». Аналитическая биохимия. 402 (1): 105–106. Дои:10.1016 / j.ab.2010.03.026. ISSN  0003-2697. ЧВК  2885848. PMID  20347671.
  14. ^ Lagendijk, Ellen L .; Валидов, Шамиль; Ламерс, Герда E.M .; Де Верт, Сандра; Блумберг, Гвидо В. (04.03.2010). «Генетические инструменты для маркировки грамотрицательных бактерий с помощью mCherry для визуализации in vitro и в естественных средах обитания, биопленки и исследования патогенности». Письма о микробиологии FEMS. 305 (1): 81–90. Дои:10.1111 / j.1574-6968.2010.01916.x. ISSN  0378-1097. PMID  20180857.

внешняя ссылка

  • мЧерри on FPbase, база данных флуоресцентных белков