Электронная дифракция на микрокристаллах - Microcrystal electron diffraction

Электронная дифракция на микрокристаллах, или же MicroED,[1][2] это КриоЭМ метод, разработанный Гонен лаборатории в конце 2013 г. Исследовательский кампус Janelia из Медицинский институт Говарда Хьюза. MicroED - это форма электронная кристаллография где тонкие 3D кристаллы используются для определения структуры методом электронная дифракция.

Метод был разработан для определение структуры белков из нанокристаллы которые обычно не подходят для дифракции рентгеновских лучей из-за своего размера. Кристаллы, размер которых составляет одну миллиардную от размера, необходимого для рентгеновской кристаллографии, могут давать данные высокого качества.[3] Образцы заморожены и гидратированы, как и во всех других модальностях CryoEM, но вместо использования просвечивающий электронный микроскоп (ТЕМ ) в режиме отображения используется в дифракция режим с чрезвычайно низкой электронной экспозицией (обычно <0,01 e−/ Å2/ с). Нанокристалл подвергается воздействию дифрагирующего луча и непрерывно вращается.[2] в то время как дифракция снимается на быстрой камере как фильм.[2] Затем данные MicroED обрабатываются с использованием традиционного программного обеспечения для Рентгеновская кристаллография без необходимости в специализированном программном обеспечении для анализа и уточнения структуры.[4] Важно отметить, что и оборудование, и программное обеспечение, используемое в эксперименте MicroED, стандартны и широко доступны.

Разработка

О первой успешной демонстрации MicroED сообщил в 2013 г. Гонен лаборатория.[1] Структура лизоцим, классический тестовый белок в Рентгеновская кристаллография. Ранее в 2013 году группа Abrahams независимо сообщила о 3D электронная дифракция данные с использованием Медипикс квантовый детектор области на лизоцим кристаллы, но не смогли решить структуру из-за технических ограничений.[5]

Экспериментальная установка

Опубликованы подробные протоколы настройки электронного микроскопа и сбора данных.[6]

Приборы

Микроскоп

Данные MicroED собираются с использованием просвечивающая электронная (криогенная) микроскопия. Микроскоп должен быть оснащен апертурой для выбранной области для использования выбранная область дифракции.

Детекторы

Для сбора данных дифракции электронов в экспериментах MicroED использовались различные детекторы. Детекторы, использующие устройство с зарядовой связью (CCD) и комплементарный металл-оксид-полупроводник (CMOS) технологии были использованы. С помощью КМОП-детекторов можно интерпретировать индивидуальный счет электронов.[7]

Сбор информации

Еще дифракция

Первоначальное доказательство публикации концепции MicroED использовало кристаллы лизоцима.[1] С одного нанокристалла было собрано до 90 градусов данных с дискретными шагами между кадрами в 1 градус. Каждая дифракционная картина была получена при сверхнизкой мощности дозы ~ 0,01 эл.−/ Å2/ с. Данные от 3 кристаллов были объединены для получения структуры с разрешением 2,9 Å с хорошей статистикой уточнения и представляли первый случай, когда дифракция электронов была успешно использована для определения структуры дозозависимого белка из трехмерных микрокристаллов в криогенных условиях.

Непрерывное вращение ступени

Вскоре после проверки принципа работы MicroED была улучшена путем применения непрерывного вращения во время схемы сбора данных.[2] Здесь кристалл медленно вращается в одном направлении, в то время как дифракция записывается на быструю камеру как фильм. Методология похожа на метод вращения в рентгеновской кристаллографии. Это привело к нескольким улучшениям качества данных и позволило обрабатывать данные с помощью стандартного программного обеспечения для рентгеновской кристаллографии.[2] Преимущества непрерывного вращения MicroED включают уменьшение динамического рассеяния и улучшенную выборку обратного пространства. Непрерывное вращение является стандартным методом сбора данных MicroED с 2014 года.

Обработка данных

Опубликованы подробные протоколы обработки данных MicroED.[4] Когда данные MicroED собираются с использованием непрерывного вращения столика, стандартное программное обеспечение для кристаллографии может быть использован.

Отличия MicroED от других методов дифракции электронов

Другие методы дифракции электронов, которые были разработаны для материаловедения для нечувствительных к излучению материалов, таких как неорганические соли, включают автоматизированную дифракционную томографию (ADT).[8] и вращательной электронографии (RED[9]). Эти методы существенно отличаются от MicroED: в ADT дискретные шаги гониометр Наклон используются для покрытия обратного пространства в сочетании с прецессией пучка для заполнения промежутков.[8] ADT использует специализированное оборудование для прецессионной и сканирующей просвечивающей электронной микроскопии для отслеживания кристаллов.[8] КРАСНЫЙ цвет выполняется в ПЭМ, но гониометр наклоняется дискретно, и наклон луча используется для заполнения промежутков.[9] Для обработки данных ADT и RED используется специализированное программное обеспечение.[9] Важно отметить, что ADT и RED были разработаны и испытаны на нечувствительных к радиации неорганических материалах и солях и не были продемонстрированы для использования с белками или чувствительными к излучению органическими материалами, изученными в замороженном гидратированном состоянии.

Вехи

Объем метода

MicroED использовался для определения структуры крупных глобулярных белков,[10] мелкие белки,[2] пептиды,[11] мембранные белки,[12] Органические молекулы,[13][14] и неорганические соединения.[15] Во многих из этих примеров наблюдались водород и заряженные ионы.[11][12]

Новые структуры α-синуклеина болезни Паркинсона

Первые новые структуры, решенные MicroED, были опубликованы в конце 2015 года.[11] Эти структуры состояли из пептидных фрагментов, которые образуют токсичное ядро α-синкулеин, белок, ответственный за болезнь Паркинсона и привести к пониманию механизма агрегации токсичных агрегатов. Структуры расшифрованы с разрешением 1,4 Å.

Новая белковая структура R2lox

Первая новая структура белка, решенная с помощью MicroED, была опубликована в 2019 году.[16] Белок представляет собой металлофермент R2-подобную лиганд-связывающую оксидазу (R2lox) из Sulfolobus acidocaldarius. Структура была расшифрована с разрешением 3,0 Å путем молекулярной замены с использованием модели 35% идентичности последовательностей, построенной на основе ближайшего гомолога с известной структурой. Эта работа продемонстрировала, что MicroED можно использовать для получения неизвестной структуры белка.

Доступ к образованию и услугам MicroED

Чтобы узнать больше о MicroED, можно посетить ежегодный Курс по Центру визуализации MicroED в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе или Курс MicroED в Diamond Light Source . Для получения более свежей информации о предстоящих встречах и семинарах, связанных с Криогенная электронная микроскопия методы в целом, проверьте Страница встреч и семинаров 3DEM.

Несколько университетов и компаний предлагают услуги MicroED, в том числе MEDIC - Центр микрокристаллической электронной дифракции в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе и Услуги наноизображения.

Рекомендации

  1. ^ а б c Ши, Дан; Nannenga, Brent L; Иаданза, Мэтью Г.; Гонен, Тамир (19 ноября 2013 г.). «Трехмерная электронная кристаллография микрокристаллов белков».. eLife. 2: e01345. Дои:10.7554 / elife.01345. ISSN  2050-084X. ЧВК  3831942. PMID  24252878.
  2. ^ а б c d е ж Nannenga, Brent L; Ши, Дан; Лесли, Эндрю Г. В.; Гонен, Тамир (2014-08-03). «Определение структуры с высоким разрешением путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED». Методы природы. 11 (9): 927–930. Дои:10.1038 / nmeth.3043. ISSN  1548-7091. ЧВК  4149488. PMID  25086503.
  3. ^ де ла Крус, М. Джейсон; Хаттне, Йохан; Ши, Дан; Зайдлер, Пол; Родригес, Хосе; Рейес, Фрэнсис Э; Савая, Майкл Р.; Cascio, Duilio; Вайс, Саймон С (2017). «Структуры с атомным разрешением из фрагментированных кристаллов белка с помощью метода криоЭМ MicroED». Методы природы. 14 (4): 399–402. Дои:10.1038 / nmeth.4178. ISSN  1548-7091. ЧВК  5376236. PMID  28192420.
  4. ^ а б Хаттне, Йохан; Рейес, Фрэнсис Э .; Nannenga, Brent L .; Ши, Дан; де ла Крус, М. Джейсон; Лесли, Эндрю Г. В .; Гонен, Тамир (01.07.2015). «Сбор и обработка данных MicroED». Acta Crystallographica Раздел A. 71 (4): 353–360. Дои:10.1107 / с2053273315010669. ISSN  2053-2733. ЧВК  4487423. PMID  26131894.
  5. ^ Nederlof, I .; van Genderen, E .; Li, Y.-W .; Абрахамс, Дж. П. (01.07.2013). «Детектор квантовой площади Medipix позволяет собирать данные ротационной дифракции электронов с субмикрометровых трехмерных кристаллов белка». Acta Crystallographica Раздел D: Биологическая кристаллография. 69 (7): 1223–1230. Дои:10.1107 / S0907444913009700. ISSN  0907-4449. ЧВК  3689525. PMID  23793148.
  6. ^ Ши, Дан; Nannenga, Brent L; де ла Крус, М. Джейсон; Лю, Цзиньян; Sawtelle, Стивен; Калеро, Гильермо; Рейес, Фрэнсис Э; Хаттне, Йохан; Гонен, Тамир (2016-04-14). «Сбор данных MicroED для кристаллографии макромолекул». Протоколы природы. 11 (5): 895–904. Дои:10.1038 / nprot.2016.046. ISSN  1754-2189. ЧВК  5357465. PMID  27077331.
  7. ^ Смотрите также https://www.gatan.com/ccd-vs-cmos и https://www.gatan.com/techniques/imaging.
  8. ^ а б c Mugnaioli, E .; Горелик, Т .; Колб, У. (2009). ""Ab initio «структурное решение на основе данных дифракции электронов, полученных с помощью комбинации автоматической дифракционной томографии и техники прецессии». Ультрамикроскопия. 109 (6): 758–765. Дои:10.1016 / j.ultramic.2009.01.011. ISSN  0304-3991. PMID  19269095.
  9. ^ а б c Ван, Вэй; Сунь, Цзюньлянь; Су, Джи; Ховмёллер, Свен; Цзоу, Сяодун (15.11.2013). «Трехмерная вращательная дифракция электронов: программное обеспечение RED для автоматического сбора и обработки данных». Журнал прикладной кристаллографии. 46 (6): 1863–1873. Дои:10.1107 / s0021889813027714. ISSN  0021-8898. ЧВК  3831301. PMID  24282334.
  10. ^ Nannenga, Brent L; Ши, Дан; Хаттне, Йохан; Рейес, Фрэнсис Э; Гонен, Тамир (10.10.2014). «Структура каталазы, определенная MicroED». eLife. 3: e03600. Дои:10.7554 / elife.03600. ISSN  2050-084X. ЧВК  4359365. PMID  25303172.
  11. ^ а б c Rodriguez, J.A .; Иванова, М .; Sawaya, M.R .; Cascio, D .; Reyes, F .; Ши, Д .; Johnson, L .; Guenther, E .; Сангван, С. (09.09.2015). «Структура MicroED сегмента, GVVHGVTTVA, из семейного мутанта A53T белка болезни Паркинсона, остатки альфа-синуклеина 47-56». Дои:10.2210 / pdb4znn / pdb. Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  12. ^ а б Liu, S .; Гонен, Т. (12 сентября 2018 г.). «Структура MicroED ионного канала NaK показывает процесс распределения Na + в фильтре селективности». Дои:10.2210 / pdb6cpv / pdb. Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  13. ^ Галлахер-Джонс, Маркус; Глинн, Калина; Boyer, David R .; Martynowycz, Michael W .; Эрнандес, Эвелин; Мяо, Дженнифер; Зи, Чи-Те; Новикова Ирина В .; Гольдшмидт, Лукаш (2018-01-15). «Крио-ЭМ структура суб-Ангстрема прионной протофибриллы обнаруживает полярный кламмер». Структурная и молекулярная биология природы. 25 (2): 131–134. Дои:10.1038 / s41594-017-0018-0. ISSN  1545-9993. ЧВК  6170007. PMID  29335561.
  14. ^ Джонс, Кристофер; Мартынович, М; Хаттне, Йохан; Фултон, Тайлер Дж .; Штольц, Брайан М .; Родригес, Хосе А .; Нельсон, Осия; Гонен, Тамир (2018). «Метод криоЭМ MicroED как мощный инструмент для определения структуры малых молекул» (PDF). Дои:10.26434 / chemrxiv.7215332.v1. Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  15. ^ Вергара, Сандра; Lukes, Dylan A .; Martynowycz, Michael W .; Сантьяго, Улисес; Plascencia-Villa, Germán; Weiss, Simon C .; де ла Крус, М. Джейсон; Блэк, Дэвид М .; Альварес, Маркос М. (31.10.2017). «Структура MicroED Au146 (p-MBA) 57 при субатомном разрешении выявляет двойной кластер FCC». Письма в Журнал физической химии. 8 (22): 5523–5530. Дои:10.1021 / acs.jpclett.7b02621. ISSN  1948-7185. ЧВК  5769702. PMID  29072840.
  16. ^ Сюй, Хунъи; Лебретт, Гюго; Clabbers, Max T. B .; Чжао, Цзинцзин; Гризе, Джулия Дж .; Цзоу, Сяодун; Мартин Хёгбом (7 августа 2019 г.). «Решение новой структуры белка R2lox с помощью дифракции электронов на микрокристаллах». Достижения науки. 5 (8): eaax4621. Дои:10.1126 / sciadv.aax4621.

дальнейшее чтение