Фазорный подход к времени жизни флуоресценции и спектральной визуализации - Phasor approach to fluorescence lifetime and spectral imaging

Синусоидальная волна с фазой φ.

Векторное представление волн и их суперпозиция.

Фазор Подход относится к методу, который используется для векторного представления синусоидальных волн, таких как переменные токи и напряжения или электромагнитные волны. Амплитуда и фаза сигнала преобразуются в вектор, где фаза переводится в угол между вектором вектора и осью X, а амплитуда преобразуется в длину или величину вектора. В этой концепции представление и анализ становятся очень простыми а сложение двух волновых форм осуществляется их векторным суммированием.

В Флуоресценция время жизни и спектральные изображения, вектор может быть использован для визуализации спектров и кривых затухания.^[1]^[2] В этом методе Преобразование Фурье из спектр или рассчитывается кривая затухания, и полученное комплексное число наносится на двухмерный график, где ось X представляет действительный компонент, а ось Y представляет мнимый компонент. Это облегчает анализ, поскольку каждый спектр и каждый распад преобразуются в уникальное положение на векторном графике, которое зависит от его спектральной ширины или максимума излучения или от его среднего времени жизни. Самая важная особенность этого анализа заключается в том, что он быстрый и обеспечивает графическое представление измеренной кривой.

Временной вектор

Если у нас есть кривая распада, которая представлена экспоненциальная функция при времени жизни τ:

${ displaystyle d (t) = {d_ {0} {e} ^ {- t / tau}}}$

Временной вектор для кривых затухания с разным временем жизни.

Тогда преобразование Фурье при частота ω представляется функцией Лоренца:

${ Displaystyle D ( omega) = { frac {1} {1 + j omega tau}} = { frac {1} {1 + j omega tau}} { frac {1-j omega tau} {1-j omega tau}} = { frac {1-j omega tau} {1 + ( omega tau) ^ {2}}} = { frac {1} { 1 + ( omega tau) ^ {2}}} - j { frac { omega tau} {1 + ( omega tau) ^ {2}}}}$

Это сложная функция, и отображение мнимой и действительной части этой функции для всех возможных времен жизни будет полукругом, где нулевое время жизни находится в точке (1,0), а бесконечное время жизни - в точке (0,0). При изменении времени жизни от нуля до бесконечности точка вектора перемещается по полукругу от (1,0) до (0,0). Это говорит о том, что, взяв преобразование Фурье измеренной кривой затухания и отобразив результат на графике векторов, время жизни можно оценить по положению фазора на полукруге.

Явно время жизни можно измерить по величине фазора следующим образом:

${ displaystyle tau = { frac {1} { omega}} { frac { operatorname {Im} D ( omega)} { operatorname {Re} D ( omega)}}}$

Это очень быстрый подход по сравнению с методами, в которых для оценки срока службы используется фитинг.

Изображение интенсивности, вектора и времени жизни клеток, трансфицированных с помощью Alexa 488 и Alexa 555.

Многоэкспоненциальные случаи

Полукругом представлены все возможные одиночные экспоненциальные затухания флуоресценции. Когда измеренная кривая затухания состоит из суперпозиции различных моноэкспоненциальных затуханий, фазор попадает внутрь полукруга в зависимости от дробных вкладов компонентов. Для биэкспоненциального случая с временами жизни τ₁ и τ₂, все значения векторов попадают на линию, соединяющую векторы вектора τ₁ и τ₂ на полукруге, а расстояние от фазора до τ₁ определяет дробь α. Следовательно, значения векторов пикселей изображения с двумя составляющими времени жизни распределяются на линии, соединяющей векторы τ₁ и τ₂. Если провести прямую через эти точки вектора с наклоном (v) и пересечением (u), получится два пересечения с полукругом, которые определяют время жизни τ₁ и τ₂:^[3]

${ displaystyle {{ tau} _ {1,2}} = { frac {1 pm { sqrt {1-4u (u + v)}}} {2 omega u}}}$

Это слепое решение для разделения двух компонентов на основе их времени жизни, при условии, что затухание флуоресценции отдельных компонентов демонстрирует единственное экспоненциальное поведение.

Совместимость с различными конфигурациями ворот

Контрольный полукруг для различных конфигураций ворот.

Для системы с дискретным числом ворот и ограниченным временным окном необходимо принять векторный подход. Уравнение для контрольного полукруга изменено на:^[4]

${ displaystyle {D} '( omega) = { frac { sinh left ({ frac {T} {2K tau}} right)} { sinh left ({ frac {1-j omega tau} { frac {2K tau} {T}}} right)}}}$

Где K - количество ворот, а T - полное окно измерения. Среднее время жизни рассчитывается следующим образом: И для двоичного случая после подгонки линии через набор данных векторов и нахождения склон (v) и время перехвата (u) рассчитываются по формуле:

${ displaystyle {{ tau} _ {1,2}} = { frac { frac {T} {2K}} {Arccoth left ( pm { frac {{ sqrt {1-2 {{u) } ^ {2}} - left (4uv + 2 {{u} ^ {2}} right) cos left (n omega { frac {T} {2K}} right)}} pm 1} {2u sin left (n omega { frac {T} {2K}} right)}} right)}}}$

Эффект отклика прибора

В неидеальных и реальных ситуациях измеренная кривая затухания представляет собой свертка отклика прибора (лазерный импульс, искаженный системой) с экспоненциальная функция что усложняет анализ. Для решения этой проблемы было разработано большое количество методов, но в векторном подходе это просто решается тем фактом, что преобразование Фурье свертки является продуктом преобразований Фурье. Это позволяет учесть влияние отклика прибора, приняв преобразование Фурье функции отклика прибора и разделив общий вектор на преобразование отклика прибора.

Спектральный вектор

Подобно временному фазору, преобразование Фурье спектров может использоваться для создания фазора. Рассматривая гауссовский спектр с нулевой спектральной шириной и изменяя максимум излучения от нулевого канала до K, вектор вращается по окружности от малых углов к большим. Это соответствует теореме сдвига преобразования Фурье. Изменение ширины спектра от нуля до бесконечности перемещает вектор к центру. Это означает, что вектор фонового сигнала, который можно рассматривать как спектр с бесконечной спектральной шириной, расположен в центре вектора с координатой (0,0).

Поведение фазора для разной ширины спектра.

Поведение фазора для разных максимумов излучения.

Линейное свойство векторного подхода

Одним из интересных свойств подхода векторов является линейность, при которой суперпозиция различных спектров или кривых затухания может быть проанализирована посредством векторной суперпозиции отдельных векторов. Это продемонстрировано на рисунке, где добавление двух спектров с разными максимумами излучения привело к получению вектора, который попадает на линию, соединяющую векторы отдельных векторов. Для тройной системы добавление трех спектров попадает внутрь треугольника, образованного векторами отдельных спектров или распадов.

Линейное свойство векторного подхода.

Чтобы найти дробные интенсивности или вклад чистых спектров, нам нужно определить площадь, которая получается путем соединения вектора полного спектра (показан желтым вектором) с вектором чистых спектров, которые показаны ( A1, A2, A3).

Разделение трех компонентов

Для системы, состоящей из трех различных компонентов и показывающих разные спектры, вектор пикселей с разной относительной интенсивностью попадает внутрь треугольника, где вершины составлены вектором чистых компонентов. Затем дробные интенсивности могут быть оценены путем измерения площади треугольника, который каждый вектор образует с вектором чистой вершины.

Изображение интенсивности, изображение Phasor и результаты без смешивания для клетки, трансфицированной DAPI, BODIPY и техасским красным, показаны синим, зеленым и красным соответственно.

Взаимная собственность

Это еще одна интересная особенность: существует взаимно однозначная корреляция между пикселями изображения и их векторами на векторном графике в зависимости от их спектра или кривой затухания. Векторы пикселей с аналогичными временноспектральными свойствами попадают в аналогичные области, и это обеспечивает средство для сортировки пикселей изображения в соответствии с их временноспектральными свойствами. Путем создания интересующей области на векторном графике может быть выполнено обратное преобразование, и векторы могут быть спроецированы обратно на изображение, что позволяет выполнить базовую сегментацию.

внешняя ссылка

Инструменты анализа времени жизни и спектрального анализа в ImageJ: http://spechron.com
Программное обеспечение Globals для спектроскопии и изображений

[1] Дигман, Мишель А. и др. «Фазорный подход к анализу визуализации времени жизни флуоресценции». Биофизический журнал 94.2 (2008): L14-L16.

[2] Ферейдуни, Фарзад, Арьен Н. Бадер и Ханс К. Герритсен. «Спектральный фазорный анализ позволяет быстро и надежно разделить спектральные изображения флуоресцентной микроскопии». Оптика Экспресс 20.12 (2012): 12729-12741.

[3] Клейтон, Эндрю А. Х., Квентин С. Хэнли и Питер Дж. Вервир. «Графическое представление и многокомпонентный анализ одночастотных данных микроскопии времени жизни флуоресценции». J. Microsc. 213 (2004): 1-5.

[4] Fereidouni, F., et al. «Модифицированный векторный подход для анализа изображений с временным интервалом времени жизни флуоресценции». Журнал микроскопии 244.3 (2011): 248-258.

[1]

[2]

[3]

[4]