Клонирование ТА - TA cloning

Клонирование ТА (также известен как быстрое клонирование или Т клонирование) это субклонирование техника, позволяющая избежать использования рестрикционные ферменты[1] и это проще и быстрее, чем традиционное субклонирование. Техника опирается на способность аденин (А) и тимин (T) (комплементарные пары оснований) на разных фрагментах ДНК для гибридизации и в присутствии лигаза, становятся связанными вместе. ПЦР продукты обычно усиливаются с помощью ДНК-полимераза Taq который предпочтительно добавляет аденин к 3'-концу продукта. Такие вставки, амплифицированные ПЦР, клонируются в линеаризованные векторов которые имеют дополнительные 3 ' тимин свесы.[2]

Процедура

Схема клонирования ТА.
Схема клонирования ТА.

Создание вставки

Вставка создается с помощью ПЦР с использованием Полимераза Taq. У этой полимеразы отсутствует корректирующая активность от 3 'до 5' и, с большой вероятностью, она добавляет одну 3'-аденин выступают на каждом конце продукта ПЦР. Лучше всего, если праймеры для ПЦР имеют гуанины на 5'-конце, поскольку это максимизирует вероятность того, что ДНК-полимераза Taq добавит концевой аденозиновый выступ.[3] Не следует использовать термостабильные полимеразы, обладающие значительной экзонуклеазной активностью от 3´ до 5´, поскольку они не покидают выступающие 3´ аденина.[4]

Создание вектора

Вектор-мишень линеаризуют и разрезают рестрикционным ферментом с тупым концом. Затем к этому вектору добавляется дидезокситимидинтрифосфат (ddTTP), используя терминальная трансфераза. Важно использовать ddTTP, чтобы обеспечить добавление только одного остатка T. Этот хвост оставляет вектор с одним 3'-выступающим остатком тимина на каждом тупом конце.[5] Производители обычно продают «наборы» для клонирования ТА с широким спектром подготовленных векторов, которые уже были линеаризованы и помечены выступающим тимином.

Преимущества и недостатки

Учитывая, что нет необходимости в рестрикционных ферментах, кроме создания линеаризованного вектора, процедура намного проще и быстрее, чем традиционные субклонирование. Также нет необходимости добавлять сайты рестрикции при разработке праймеров, и, таким образом, можно использовать более короткие праймеры, экономя время и деньги. Кроме того, в случаях, когда нет жизнеспособных сайтов рестрикции, которые можно использовать для традиционного клонирования, клонирование ТА часто используется в качестве альтернативы. Основным недостатком клонирования ТА является то, что направленное клонирование невозможно, поэтому вероятность клонирования гена в обратном направлении составляет 50%.[1]

использованная литература

  1. ^ а б «Улучшенное клонирование ТА». Caister Academic Press. Архивировано из оригинал на 2011-07-08. Получено 2009-10-17.
  2. ^ «Клонирование ТА». www.premierbiosoft.com. Получено 2017-02-05.
  3. ^ «Протокол клонирования ТА». Дарем, Нью-Гэмпшир, США: Центр геномных исследований Хаббарта. Архивировано из оригинал на 2008-12-02. Получено 2009-10-17.
  4. ^ «Руководство по набору для клонирования TA» (PDF). Invitrogen. 7 апреля 2004 г. с. 31. Архивировано с оригинал (PDF) 24 июня 2010 г.. Получено 2009-10-17.
  5. ^ Holton, T.A .; Грэм, M.W (1991-03-11). «Простой и эффективный метод прямого клонирования продуктов ПЦР с использованием векторов с ddT-хвостом». Исследования нуклеиновых кислот. 19 (5): 1156. Дои:10.1093 / nar / 19.5.1156. ЧВК  333802. PMID  2020554.

Смотрите также

Клонирование ТОПО