Зажим напряжения - Voltage clamp

Не путать с зажим (электроника).
Зажим напряжения работает от негативный отзыв. В мембранный потенциал усилитель мощности меры мембрана Напряжение и отправляет выходной сигнал на усилитель обратной связи; это вычитает мембранное напряжение из командного напряжения, которое он получает от генератора сигналов. Этот сигнал усиливается и выводится на аксон через Текущий -поездка электрод.

В зажим напряжения экспериментальный метод, используемый электрофизиологи измерить ион токи сквозь мембраны возбудимых клеток, таких как нейроны, удерживая мембрану Напряжение на заданном уровне.[1] Базовый зажим напряжения будет многократно измерять мембранный потенциал, а затем измените мембранный потенциал (напряжение) до желаемого значения, добавив необходимый ток. Это «зажимает» клеточную мембрану желаемым постоянным напряжением, позволяя зажиму напряжения записывать, какие токи подаются. Поскольку токи, приложенные к ячейке, должны быть равны (и противоположны в обвинять к) ток, протекающий через клеточную мембрану при заданном напряжении, записанные токи показывают, как клетка реагирует на изменения мембранного потенциала.[2] Клеточные мембраны возбудимых клеток содержат множество различных видов ионные каналы, некоторые из которых закрытый по напряжению. Зажим напряжения позволяет управлять напряжением мембраны независимо от ионных токов, позволяя ток – напряжение взаимоотношения мембранных каналов, которые необходимо изучить.[3]

История

Концепция зажима напряжения связана с Кеннет Коул[4] и Джордж Мармонт[5] весной 1947 г.[6] Они вставили внутренний электрод в гигантский аксон кальмара и начали подавать ток. Коул обнаружил, что можно использовать два электроды и цепь обратной связи сохранить клетки мембранный потенциал на уровне, установленном экспериментатором.

Коул разработал технику фиксации напряжения до эры микроэлектроды, поэтому два его электрода состояли из тонких проводов, скрученных вокруг изоляционный стержень. Поскольку электроды этого типа можно было вставить только в самые большие ячейки, первые электрофизиологические эксперименты проводились почти исключительно на Кальмар аксоны.

Личное фото Кеннета Коула, переданное доктору Дж. Уолтеру Вудбери.

Кальмары брызгают струями воды, когда им нужно быстро двигаться, например, когда они убегают от хищника. Чтобы побег как можно быстрее, у них есть аксон которые могут достигать 1 мм в диаметре (сигналы быстрее распространяются по крупным аксонам). В гигантский аксон кальмара был первым препаратом, который можно было использовать для фиксации напряжения трансмембранного тока, и он стал основой новаторских экспериментов Ходжкина и Хаксли по свойствам потенциала действия.[6]

Алан Ходжкин поняли, что для понимания потока ионов через мембрану необходимо устранить различия в мембранном потенциале.[7] Используя эксперименты с зажимом напряжения, Ходжкина и Эндрю Хаксли опубликовал 5 статей летом 1952 г., описывающих, как ионные токи вызывают потенциал действия.[8] В заключительном документе предлагается Модель Ходжкина – Хаксли который математически описывает потенциал действия. Использование зажимов напряжения в их экспериментах для изучения и детального моделирования потенциала действия заложило основу для электрофизиология; для которого они разделили 1963 Нобелевская премия по физиологии и медицине.[7]

Техника

Зажим напряжения представляет собой генератор тока. Трансмембранное напряжение регистрируется через «электрод напряжения» относительно земля, а «токовый электрод» пропускает ток в ячейку. Экспериментатор устанавливает «удерживающее напряжение» или «командный потенциал», и фиксатор напряжения использует отрицательную обратную связь, чтобы поддерживать ячейку на этом напряжении. Электроды подключены к усилителю, который измеряет мембранный потенциал и передает сигнал в усилитель обратной связи. Этот усилитель также получает входной сигнал от генератора сигналов, который определяет командный потенциал, и вычитает мембранный потенциал из командного потенциала (Vкоманда - Vм), увеличивает любую разницу и отправляет выходной сигнал на токовый электрод. Всякий раз, когда ячейка отклоняется от удерживающего напряжения, операционный усилитель генерирует «сигнал ошибки», то есть разницу между командным потенциалом и фактическим напряжением ячейки. В цепь обратной связи пропускает ток в ячейку, чтобы уменьшить сигнал ошибки до нуля. Таким образом, зажимная цепь производит ток, равный ионному току и противоположный ему.

Варианты техники фиксации напряжения

Двухэлектродный фиксатор напряжения с использованием микроэлектродов

Двухэлектродный зажим напряжения

Техника двухэлектродного зажима напряжения (TEVC) используется для изучения свойств мембранных белков, особенно ионных каналов.[9] Исследователи чаще всего используют этот метод для исследования мембранных структур, выраженных в Xenopus ооциты. Большой размер этих ооцитов позволяет легко манипулировать ими.[10]

В методе TEVC используются две пипетки с низким сопротивлением, одна измеряет напряжение, а другая вводит ток. Микроэлектроды заполняются проводящим раствором и вставляются в ячейку для искусственного контроля мембранного потенциала. Мембрана действует как диэлектрик также как и резистор, в то время как жидкости по обе стороны от мембраны функционируют как конденсаторы.[10] Микроэлектроды сравнивают мембранный потенциал с командным напряжением, обеспечивая точное воспроизведение токов, протекающих через мембрану. Текущие показания могут быть использованы для анализа электрического отклика ячейки на различные приложения.

Этот метод предпочтительнее, чем зажим с одним микроэлектродом или другие методы фиксации напряжения, когда условия требуют разрешения больших токов. Высокая пропускная способность двухэлектродного зажима позволяет фиксировать большие токи, которые невозможно контролировать с помощью одноэлектродного устройства. патч методы.[11] Двухэлектродная система также желательна из-за быстрого времени установления зажима и низкого уровня шума. Однако использование TEVC ограничено размером ячеек. Он эффективен для ооцитов большего диаметра, но его труднее использовать с мелкими клетками. Кроме того, метод TEVC ограничен тем, что датчик тока должен находиться в пипетке. Во время зажима невозможно манипулировать внутриклеточной жидкостью, что возможно с использованием методов зажима пластыря.[12] Другой недостаток связан с проблемами "пространственного зажима". Коула В зажиме напряжения использовался длинный провод, который равномерно зажимал аксон кальмара по всей его длине. Микроэлектроды TEVC могут обеспечить только пространственное точечный источник тока, который не может равномерно влиять на все части элемента неправильной формы.

Двухэлементный зажим напряжения

Техника двухэлементного зажима напряжения представляет собой специализированный вариант двухэлектродного зажима напряжения и используется только при исследовании щелевой переход каналы.[13] Щелевые соединения - это поры, которые напрямую связывают две клетки, через которые свободно проходят ионы и небольшие молекулы. Когда две клетки, в которых белки щелевого соединения, обычно коннексины или же иннексины, экспрессируются либо эндогенно, либо путем инъекции мРНК, между ячейками образуется соединительный канал. Поскольку в системе присутствуют две ячейки, используются два набора электродов. Регистрирующий электрод и электрод для подачи тока вставляются в каждую ячейку, и каждая ячейка зажимается отдельно (каждый набор электродов присоединяется к отдельному устройству, а интегрирование данных выполняется компьютером). Для записи соединительных проводимость, ток изменяется в первой ячейке, в то время как записывающий электрод во второй ячейке записывает любые изменения Vм только для второй ячейки. (Этот процесс можно обратить вспять, если стимул возникает во второй ячейке, а запись происходит в первой ячейке.) Поскольку электрод в записываемой ячейке не вызывает изменения тока, любое изменение напряжения должно быть вызвано пересечением тока в записываемая ячейка через каналы щелевого перехода от ячейки, в которой изменялся ток.[13]

Одноэлектродный зажим напряжения

В этой категории описывается набор методов, в которых один электрод используется для фиксации напряжения. Метод непрерывного одноэлектродного зажима (SEVC-c) часто используется с записью патч-зажима. Метод прерывистого одноэлектродного фиксирования напряжения (SEVC-d) используется с проникающей внутриклеточной записью. Этот единственный электрод выполняет функции как подачи тока, так и регистрации напряжения.

Непрерывный одноэлектродный зажим (SEVC-c)

Основная статья: патч зажим

Метод «патч-кламп» позволяет исследовать отдельные ионные каналы. В нем используется электрод с относительно большим наконечником (> 1 микрометра), который имеет гладкую поверхность (а не острый наконечник). Это «электрод с фиксатором» (в отличие от «острого электрода», используемого для прокалывания клеток). Этот электрод прижимается к клеточной мембране, и применяется всасывание, чтобы втягивать мембрану клетки внутрь наконечника электрода. Всасывание заставляет ячейку образовывать плотное уплотнение с электродом («гигаомное уплотнение», так как сопротивление больше гигаом ).

Преимущество SEV-c в том, что вы можете записывать данные с небольших ячеек, которые невозможно пронзить двумя электродами. Тем не мение:

  1. Микроэлектроды - несовершенные проводники; в общем у них сопротивление больше миллиона Ом. Они исправляются (т. Е. Меняют свое сопротивление с напряжением, часто нерегулярно), иногда они имеют нестабильное сопротивление, если они забиты содержимым ячейки. Таким образом, они не будут точно записывать напряжение элемента, особенно когда оно быстро меняется, и не будут точно пропускать ток.
  2. Ошибки напряжения и тока: схема SEV-c на самом деле не измеряет напряжение зажимаемой ячейки (как это делает двухэлектродный зажим). Усилитель патч-зажим похож на двухэлектродный зажим, за исключением того, что цепи измерения напряжения и прохождения тока соединены (в двухэлектродном зажиме они соединены через камеру). Электрод прикреплен к проводу, который контактирует с петлей тока / напряжения внутри усилителя. Таким образом, электрод имеет лишь косвенное влияние на цепь обратной связи. Усилитель считывает только напряжение в верхней части электрода и подает обратный ток для компенсации. Но если электрод является несовершенным проводником, схема зажима имеет только искаженное представление о мембранном потенциале. Точно так же, когда схема пропускает обратный ток для компенсации этого (искаженного) напряжения, ток будет искажен электродом, прежде чем достигнет ячейки. Чтобы компенсировать это, электрофизиолог использует электрод с наименьшим возможным сопротивлением, следит за тем, чтобы характеристики электрода не менялись во время эксперимента (так что ошибки будут постоянными), и избегает регистрации токов с кинетикой, которая может быть слишком быстрой для зажима. точно следовать. Точность SEV-c повышается тем медленнее и меньше изменения напряжения, которые он пытается зафиксировать.
  3. Ошибки последовательного сопротивления: токи, передаваемые в ячейку, должны уходить на землю, чтобы замкнуть цепь. Напряжения регистрируются усилителем относительно земли. Когда клетка зажата в естественном потенциал покоя, нет проблем; зажим не пропускает ток, и напряжение генерируется только элементом. Но, когда зажимается другой потенциал, ошибки последовательного сопротивления становятся проблемой; клетка будет пропускать ток через свою мембрану, пытаясь вернуться к своему естественному потенциалу покоя. Фиксирующий усилитель противодействует этому, пропуская ток для поддержания удерживающего потенциала. Проблема возникает из-за того, что электрод находится между усилителем и ячейкой; т.е. электрод последовательно с резистором, который является мембраной клетки. Таким образом, при пропускании тока через электрод и ячейку Закон Ома говорит нам, что это вызовет образование напряжения на сопротивлении как ячейки, так и электрода. Поскольку эти резисторы включены последовательно, падения напряжения будут увеличиваться. Если электрод и клеточная мембрана имеют равные сопротивления (чего они обычно не имеют), и если экспериментатор дает команду на изменение потенциала покоя на 40 мВ, усилитель будет пропускать достаточный ток, пока не покажет, что достигнуто изменение на 40 мВ. Однако в этом примере половина этого падения напряжения приходится на электрод. Экспериментатор думает, что он или она сместил напряжение ячейки на 40 мВ, но сдвинул его только на 20 мВ. Разница в «ошибке последовательного сопротивления». Современные усилители с коммутационным зажимом имеют схему для компенсации этой ошибки, но они компенсируют только 70-80% ее. Электрофизиолог может дополнительно уменьшить ошибку, регистрируя естественный потенциал покоя клетки или около него, а также используя электрод с минимальным сопротивлением, насколько это возможно.
  4. Ошибки емкости. Микроэлектроды представляют собой конденсаторы и вызывают особые хлопоты, поскольку они нелинейны. Емкость возникает из-за того, что электролит внутри электрода отделен изолятором (стеклом) от раствора снаружи. По определению и функции это конденсатор. Хуже того, поскольку толщина стекла изменяется по мере удаления от наконечника, постоянная времени конденсатора будет отличаться. Это создает искаженную запись мембранного напряжения или тока всякий раз, когда они меняются. Усилители могут компенсировать это, но не полностью, потому что емкость имеет много постоянных времени. Экспериментатор может уменьшить проблему, сохраняя раствор для купания в ячейке неглубоким (подвергая меньшую поверхность стекла воздействию жидкости) и покрывая электрод силиконом, смолой, краской или другим веществом, которое увеличивает расстояние между внутренним и внешним растворами.
  5. Ошибки пространственного зажима. Одиночный электрод - это точечный источник тока. В удаленных частях ячейки ток, проходящий через электрод, будет менее влиятельным, чем в соседних частях ячейки. Это особенно проблема при записи нейронов со сложными дендритными структурами. С ошибками пространственного зажима ничего нельзя поделать, кроме как смягчить выводы эксперимента.

Прерывистый одноэлектродный фиксатор напряжения (SEVC-d)

Одноэлектродный фиксатор напряжения - прерывистый, или SEVC-d, имеет некоторые преимущества перед SEVC-c для записи целых клеток. В этом случае используется другой подход к пропусканию тока и записи напряжения. Усилитель SEVC-d работает на "совместное времяпровождение "основание, поэтому электрод регулярно и часто переключается между проходящим током и измеряемым напряжением. Фактически, есть два электрода, но каждый работает только половину времени, в течение которого он включен. Колебание между двумя функциями одного электрода называется рабочим циклом. Во время каждого цикла усилитель измеряет мембранный потенциал и сравнивает его с удерживающим потенциалом. операционный усилитель измеряет разницу и генерирует сигнал ошибки. Этот ток является зеркальным отображением тока, генерируемого ячейкой. Особенности выходов усилителя образец и держать цепи, поэтому каждое кратковременно измеренное напряжение затем удерживается на выходе до следующего измерения в следующем цикле. В частности, усилитель измеряет напряжение в первые несколько микросекунд цикла, генерирует сигнал ошибки и проводит оставшуюся часть цикла, пропуская ток, чтобы уменьшить эту ошибку. В начале следующего цикла снова измеряется напряжение, генерируется новый сигнал ошибки, пропускается ток и т. Д. Экспериментатор устанавливает длину цикла, и можно производить выборку с периодами примерно 15 микросекунд, что соответствует 67 кГц. частота коммутации. Частоты переключения ниже примерно 10 кГц недостаточно при работе с потенциалами действия шириной менее 1 миллисекунды. Обратите внимание, что не все усилители с прерывистым ограничением напряжения поддерживают частоты переключения выше 10 кГц.[14]

Чтобы это работало, емкость ячейки должна быть выше емкости электрода как минимум на порядок величины. Емкость замедляет кинетику (время нарастания и спада) токов. Если емкость электрода намного меньше, чем у ячейки, то при пропускании тока через электрод напряжение электрода будет изменяться быстрее, чем напряжение ячейки. Таким образом, когда ток подается, а затем выключается (в конце рабочего цикла), напряжение электрода будет спадать быстрее, чем напряжение элемента. Как только напряжение электрода становится асимптотически равным напряжению ячейки, напряжение может быть измерено (снова) и приложена следующая величина заряда. Таким образом, частота рабочего цикла ограничена скоростью, с которой напряжение на электроде растет и спадает при прохождении тока. Чем ниже емкость электрода, тем быстрее цикл.

SEVC-d имеет большое преимущество перед SEVC-c, позволяя экспериментатору измерять мембранный потенциал, и, поскольку он исключает прохождение тока и измерение напряжения одновременно, никогда не возникает ошибки последовательного сопротивления. Основные недостатки - ограниченное временное разрешение и нестабильность усилителя. Если он пропускает слишком большой ток, что приводит к превышению целевого напряжения, он меняет полярность тока в следующем рабочем цикле. Это приводит к понижению целевого напряжения, поэтому следующий цикл снова меняет полярность подаваемого тока. Эта ошибка может расти с каждым циклом, пока усилитель не выйдет из-под контроля («звенящий»); обычно это приводит к разрушению записываемой ячейки. Исследователю нужен короткий рабочий цикл для улучшения временного разрешения; усилитель имеет регулируемые компенсаторы, которые ускоряют спад напряжения электрода, но, если они установлены слишком высокими, усилитель будет звонить, поэтому исследователь всегда пытается «настроить» усилитель как можно ближе к границе неконтролируемых колебаний, В этом случае небольшие изменения условий записи могут вызвать звон. Есть два решения: «вернуть» настройки усилителя в безопасный диапазон или быть готовым к появлению признаков того, что усилитель вот-вот зазвонит.

Рекомендации

  1. ^ Новотны, доктор Томас; Леви, доктор Рафаэль (2014). Джегер, Дитер; Юнг, Рану (ред.). Энциклопедия вычислительной нейробиологии. Springer Нью-Йорк. С. 1–5. Дои:10.1007/978-1-4614-7320-6_137-2. ISBN  9781461473206.
  2. ^ Hernandez-Ochoa, E. O .; Шнайдер, М. Ф. (2012). «Методы фиксации напряжения для исследования мембранных токов и SR Ca2+ высвобождение в волокнах скелетных мышц взрослых ". Прог. Биофиз. Мол. Биол. 108 (3): 98–118. Дои:10.1016 / j.pbiomolbio.2012.01.001. ЧВК  3321118. PMID  22306655.
  3. ^ Кандел, Эрик Р .; Шварц, Джеймс Харрис; Джессел, Томас М., ред. (2000). Принципы нейронологии (4-е изд.). Нью-Йорк: Макгроу-Хилл. стр.152–3. ISBN  978-0-8385-7701-1.
  4. ^ Медведь, Марк Ф .; Коннорс, Барри У .; Майкл А., ред. (2006) [1996]. Нейробиология: исследование мозга (3-е изд.). Филадельфия, Балтимор: Липпинкотт Уильямс и Уилкинс. п. 84. ISBN  978-0-7817-6003-4. LCC  QP355.2.B42.
  5. ^ Мур, Джон В .; Хайнс, Майкл Л. (1994). «Краткая история вычислительной нейробиологии». Моделирование с NEURON. Университет Дьюка.
  6. ^ а б Эндрю Хаксли, 1996, "Кеннет Стервард Коул 1900 - 1984, биографические воспоминания" Национальной академии наук. (Вашингтон, округ Колумбия.)
  7. ^ а б Хаксли, Эндрю (2002). «От выброса до ограничения напряжения». Тенденции в неврологии. 25 (11): 553–8. Дои:10.1016 / S0166-2236 (02) 02280-4. PMID  12392929. S2CID  7453707.
  8. ^ Ванденберг, Дж. И. и С. Г. Ваксман (2012). «Ходжкин и Хаксли и основа для электрических сигналов: замечательное наследие, которое до сих пор остается сильным». J. Physiol. (Оксфорд, У. К.) 590 (11): 2569–2570.
  9. ^ Guan, B .; Чен, X .; Чжан, Х. (2013). Двухэлектродный зажим напряжения. Методы молекулярной биологии. 998. С. 79–89. Дои:10.1007/978-1-62703-351-0_6. ISBN  978-1-62703-350-3. PMID  23529422.
  10. ^ а б Polder, H.R .; Свандулла, Д. (2001). «Использование теории управления для проектирования систем фиксации напряжения: простая и стандартизованная процедура для оценки параметров системы». Журнал методов неврологии. 109 (2): 97–109. Дои:10.1016 / S0165-0270 (01) 00385-5. PMID  11513944. S2CID  44840152.
  11. ^ DiFranco, M .; Herrera, A .; Вергара, Дж. Л. (2011). «Хлоридные токи из поперечной трубчатой ​​системы в волокнах скелетных мышц взрослых млекопитающих». Журнал общей физиологии. 137 (1): 21–41. Дои:10.1085 / jgp.201010496. ЧВК  3010054. PMID  21149546.
  12. ^ Hernandez-Ochoa, E .; Шнайдер, М. (2012). «Методы фиксации напряжения для исследования мембранных токов и высвобождения SR Ca (2+) в волокнах скелетных мышц взрослых». Прогресс в биофизике и молекулярной биологии. 108 (3): 98–118. Дои:10.1016 / j.pbiomolbio.2012.01.001. ЧВК  3321118. PMID  22306655.
  13. ^ а б Ван Риджен, Х. В. М .; Вилдерс, Рональд; Van Ginneken, Antoni C.G .; Jongsma, Habo J. (1998). «Количественный анализ двойного определения проводимости щелевого перехода с фиксацией напряжения для всей клетки». Pflügers Archiv. 436 (1): 141–51. Дои:10.1007 / s004240050615. PMID  9560458. S2CID  23697774.
  14. ^ Polder, H.R .; Свандулла, Д. (2001). «Использование теории управления для проектирования систем фиксации напряжения: простая и стандартизованная процедура для оценки параметров системы». Журнал методов неврологии. 109 (2): 97–109. Дои:10.1016 / S0165-0270 (01) 00385-5. PMID  11513944. S2CID  44840152.

дальнейшее чтение

  • Шерман-Голд, Ривка, изд. (1993). «Биоэлектричество» (PDF). Руководство Axon по лабораторным методам электрофизиологии и биофизики. Axon Instruments. С. 1–16. OCLC  248830666.