Агроинфильтрация - Википедия - Agroinfiltration

Agroinfiltration.jpg

Агроинфильтрация это метод, используемый в биология растений и особенно в последнее время в биотехнология растений побудить временное выражение из гены в растение, или изолированные листья растения, или даже в культурах растительных клеток, чтобы произвести желаемый белок. В методе a приостановка из Agrobacterium tumefaciens вводится в лист растения путем прямой инъекции или вакуумной инфильтрации или вводится в ассоциацию с растительными клетками, иммобилизованными на пористой подложке (пакеты растительных клеток),[1] после чего бактерии переносят желаемый ген в растение клетки через перенос Т-ДНК. Основное преимущество агроинфильтрации по сравнению с более традиционными трансформация растений скорость и удобство, хотя выходы рекомбинантного белка обычно также выше и стабильнее.

Первый шаг - ввести интересующий ген в напряжение из Agrobacterium tumefaciens. Впоследствии штамм выращивают в жидкая культура и полученные бактерии промывают и суспендируют в подходящем буферный раствор. Для инъекции этот раствор затем помещают в шприц (без иглы). Кончик шприца прижимается к нижней стороне лист одновременно прикладывая легкое противодавление к другой стороне листа. В Агробактерии затем суспензия впрыскивается в воздушное пространство внутри листа через устьица или иногда через крошечный разрез на нижней стороне листа.

Вакуумная инфильтрация - еще один способ ввести Агробактерии глубоко в ткани растений. В этой процедуре листовые диски, листья или целые растения погружают в стакан, содержащий раствор, и стакан помещают в вакуумную камеру. Затем создается вакуум, вытесняющий воздух из межклеточных пространств в листьях через устьица. Когда вакуум сбрасывается, разница давлений выталкивает суспензию «Agrobacterium» в листья через устьица в мезофилл ткань. Это может привести к тому, что почти все клетки любого листа будут контактировать с бактериями.

Оказавшись внутри листа Агробактерии остается в межклеточном пространстве и переносит интересующий ген как часть Т-ДНК, полученной из Ti-плазмиды, в большом количестве копий в клетки растений. Перенос генов происходит, когда индуцируются сигналы растений и устанавливается физический контакт между растительными клетками и бактерией. Бактерии создают механизм, который прокладывает дыру и переносит новую цепь Т-ДНК в клетку растения. Т-ДНК перемещается в ядро ​​растения и начинает интегрироваться в хромосому растения. Затем ген временно экспрессируется посредством синтеза РНК из соответствующих промоторных последовательностей во всех трансфицированных клетках (отбор на стабильную интеграцию не проводится). Завод можно контролировать на предмет возможного воздействия в фенотип, подвергнутые экспериментальным условиям или собранные и используемые для очистка белка представляет интерес. С помощью этого метода можно обрабатывать многие виды растений, но наиболее распространенными из них являются: Nicotiana benthamiana и реже, Nicotiana tabacum.

Временная экспрессия в пакетах культивируемых растительных клеток - это новая процедура, недавно запатентованная Институтом Фраунгофера IVV, Германия.[2] Для этого метода суспензионные культивированные клетки табака (например: клеточные линии NT1 или BY2 Nicotiana tabacum) иммобилизуют фильтрованием на пористой подложке с образованием хорошо аэрируемого пакета клеток, затем инкубируют с рекомбинантным Агробактерии на время, чтобы позволить перенос Т-ДНК, перед повторной фильтрацией для удаления лишних бактерий и жидкости. Инкубация клеточного пакета во влажной среде в течение периодов времени до нескольких дней обеспечивает временную экспрессию белка. Секретированные белки можно вымыть из упаковки клеток путем применения буфера и дальнейшей фильтрации.

Глушители при агроинфильтрации

Агроинфильтрация с использованием конструкции промотор :: GUS в Nicotiana benthamiana »с TBSV p19 (правый листовой диск) и без TBSV p19 (левый листовой диск).

Совместная фильтрация Агробактерии неся интересующий конструкт вместе с другим Агробактерии несущий ген белка-супрессора молчания, такой как тот, который кодирует белок p19 из патогенного растения Вирус кустистого трюка помидоров (TBSV), или белок NSs [3] из вирус пятнистого увядания томатов (TSWV). TBSV был впервые обнаружен в 1935 г. в г. помидоры и приводит к появлению растений с задержкой роста и деформированными плодами. TSWV был обнаружен в помидорах в Австралии в 1915 году и в течение многих лет был единственным представителем того, что сейчас известно как род Тосповирус, семья Bunyaviridae.

Для защиты от вирусов и других патогенов, которые вводят чужеродные нуклеиновые кислоты в свои клетки, растения разработали систему посттранскрипционное молчание генов (PTGS) где малые интерферирующие РНК производятся из двухцепочечная РНК для создания пути деградации, специфичного для последовательности, который эффективно заглушает неродные гены.[4][5] Многие вирусы растений разработали механизмы, которые противодействуют системам PTGS растений с помощью эволюционирующих белков, таких как p19 и NS, которые мешают пути PTGS на разных уровнях.[6][7][8]

Хотя неясно, как именно p19 подавляет молчание РНК, исследования показали, что временно экспрессируемые белки в Nicotiana benthamiana листья дают урожайность до 50 раз выше при совместной фильтрации с TBSV p19.[9][10]

TSWV и другие белки NS тосповируса показали свою эффективность в качестве супрессоров как местного, так и системного сайленсинга,[11] и может быть полезной альтернативой p19, когда было показано, что последний не эффективен. В других исследованиях p19 из Вирус пятнистой морщинистости артишока было показано, что он оказывает сходный, хотя и более слабый эффект, с TBSV p19.[12]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ | url =https://www.researchgate.net/project/Plant-cell-pack-aka-cookie-technology
  2. ^ «Способ создания и выращивания упаковки растительных клеток».
  3. ^ Такеда, А; Сугияма, К. Нагано, Н; Мори, М; Кайдо, М; Mise, K; Цуда, S; Окуно, Т. (2002). «Идентификация нового супрессора подавления РНК, белка NSs вируса пятнистого увядания томатов». FEBS Lett. 532 (1–2): 75–9. Дои:10.1016 / s0014-5793 (02) 03632-3. PMID  12459466.
  4. ^ Хаммонд, Скотт М .; Caudy, Эми A .; Хэннон, Грегори Дж. (Февраль 2001 г.). «Посттранскрипционное молчание генов с помощью двухцепочечной РНК». Природа Обзоры Генетика. 2 (2): 110–119. Дои:10.1038/35052556. PMID  11253050.
  5. ^ Йохансен, Лиза К .; Кэррингтон, Джеймс К. (2001-07-01). «Молчание на месте. Индукция и подавление замораживания РНК в системе временной экспрессии, опосредованной Agrobacterium». Физиология растений. 126 (3): 930–938. Дои:10.1104 / стр. 126.3.930. ISSN  1532-2548. ЧВК  1540124. PMID  11457942.
  6. ^ Анандалакшми, Радхамани; Прусс, Гейл Дж .; Ге, Синь; Марат, Раджендра; Мэллори, Эллисон С .; Смит, Трентон Х .; Вэнс, Вики Б. (1998-10-27). «Вирусный супрессор сайленсинга генов у растений». Труды Национальной академии наук. 95 (22): 13079–13084. Дои:10.1073 / пнас.95.22.13079. ISSN  0027-8424. ЧВК  23715. PMID  9789044.
  7. ^ Kasschau, Kristin D .; Кэррингтон, Джеймс К. (13 ноября 1998 г.). «Стратегия защиты от вирусов растений». Клетка. 95 (4): 461–470. Дои:10.1016 / S0092-8674 (00) 81614-1. ISSN  0092-8674. PMID  9827799.
  8. ^ Воиннет, Оливье (2001-08-01). «РНК сайленсинг как иммунная система растений против вирусов». Тенденции в генетике. 17 (8): 449–459. Дои:10.1016 / S0168-9525 (01) 02367-8. ISSN  0168-9525. PMID  11485817.
  9. ^ Воиннет, Оливье; Ривас, Сусана; Местре, Пере; Баулкомб, Дэвид (2003-03-01). «Retracted: усиленная система временной экспрессии в растениях, основанная на подавлении сайленсинга гена белком p19 вируса кустарникового роста томатов». Журнал растений. 33 (5): 949–956. Дои:10.1046 / j.1365-313X.2003.01676.x. ISSN  1365-313X. PMID  12609035. S2CID  2412771.
  10. ^ «Retraction:» Система усиленной временной экспрессии в растениях, основанная на подавлении сайленсинга генов белком p19 вируса кустарниковой остановки томата.'". Журнал растений. 84 (4): 846. 2015-11-01. Дои:10.1111 / tpj.13066. ISSN  1365-313X. PMID  27170951.
  11. ^ Хедил, М; Стеркен, MG; де Ронд, Д; Lohuis, D; Кормелинк, Р (2015). «Анализ белков NS тосповируса в подавлении системного молчания». PLOS ONE. 10 (8): e0134517. Дои:10.1371 / journal.pone.0134517. ЧВК  4537313. PMID  26275304.
  12. ^ Ломбарди, Рафаэле; Чирчелли, Патриция; Виллани, Мария; Буриани, Джампаоло; Нарди, Лука; Коппола, Валентина; Бьянко, Линда; Бенвенуто, Эухенио; Донини, Марчелло (20 ноября 2009 г.). «Высокий уровень временной экспрессии Nef ВИЧ-1 в Nicotiana benthamiana с использованием белка-супрессора, подавляющего подавление гена P19, орфографическая ошибка с крапчатой ​​морщиной артишока в названии вируса». BMC Biotechnology. 9 (1): 96. Дои:10.1186/1472-6750-9-96. ЧВК  2785776. PMID  19930574.