Трансформация (генетика) - Википедия - Transformation (genetics)

Не путать с несвязанным процессом, называемым злокачественная трансформация что происходит в прогрессии рак.
На этом изображении ген из бактериальной клетки 1 перемещается из бактериальной клетки 1 в бактериальную клетку 2. Этот процесс поглощения новым генетическим материалом бактериальной клетки 2 называется трансформацией.

В молекулярная биология и генетика, трансформация это генетический изменение клетка в результате прямого поглощения и включения экзогенный генетический материал из его окрестностей через клеточная мембрана (s). Для того чтобы трансформация произошла, бактерия-реципиент должна находиться в состоянии компетентность, которые могут возникать в природе как ограниченная по времени реакция на условия окружающей среды, такие как голодание и плотность клеток, а также могут быть индуцированы в лаборатории.[1]

Преобразование - это один из трех процессов горизонтальный перенос генов, в котором экзогенный генетический материал переходит от одной бактерии к другой, а две другие спряжение (передача генетический материал между двумя бактериальными клетками в прямом контакте) и трансдукция (инъекция чужеродной ДНК бактериофаг вирус в бактерию-хозяин).[1] При трансформации генетический материал проходит через промежуточную среду, и поглощение полностью зависит от бактерии-реципиента.[1]

На 2014 год было известно около 80 видов бактерий, способных к трансформации, примерно поровну разделенных между Грамположительный и Грамотрицательные бактерии; это число может быть завышенным, поскольку некоторые отчеты поддерживаются отдельными документами.[1]

«Трансформация» может также использоваться для описания внедрения нового генетического материала в небактериальные клетки, включая клетки животных и растений; однако, поскольку "трансформация «имеет особое значение по отношению к животным клеткам, указывая на прогрессирование до ракового состояния, этот процесс обычно называется»трансфекция ".[2]

История

Трансформация бактерий была впервые продемонстрирована в 1928 году британским бактериологом. Фредерик Гриффит.[3] Гриффита интересовало, можно ли использовать инъекции убитых нагреванием бактерий для вакцинации мышей от пневмонии. Однако он обнаружил, что невирулентный штамм Пневмококк можно сделать ядовитый после контакта с убитыми жарой вирулентными штаммами. Гриффит предположил, что некоторые "принцип преобразования "из убитого нагреванием штамма был ответственен за то, что безвредный штамм стал вирулентным. В 1944 году этот" трансформирующий принцип "был идентифицирован как генетический Освальд Эйвери, Колин МакЛауд, и Маклин Маккарти. Они выделили ДНК из вирулентного штамма S. pneumoniae и используя только эту ДНК, мы смогли сделать безвредный штамм вирулентным. Они назвали это поглощение и включение ДНК бактериями «трансформацией» (см. Эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти )[4] Результаты экспериментов Эйвери и др. Были сначала скептически восприняты научным сообществом, и только после разработки генетические маркеры и открытие других методов генетической передачи (спряжение в 1947 г. и трансдукция в 1953 г.) Джошуа Ледерберг что эксперименты Эйвери были приняты.[5]

Первоначально считалось, что кишечная палочка, широко используемый лабораторный организм, был невосприимчив к трансформации. Однако в 1970 году Мортон Мандель и Акико Хига показали, что Кишечная палочка может быть побуждено принять ДНК из бактериофаг λ без использования фаг-помощник после лечения раствором хлорида кальция.[6] Два года спустя, в 1972 году, Стэнли Норман Коэн, Энни Чанг и Лесли Хсу показали, что CaCl
2 лечение также эффективно для трансформации плазмидной ДНК.[7] Метод трансформации Манделя и Хиги был позже улучшен Дуглас Ханахан.[8] Открытие искусственно индуцированной компетентности в Кишечная палочка создали эффективную и удобную процедуру трансформации бактерий, позволяющую упростить молекулярное клонирование методы в биотехнология и исследование, и в настоящее время это обычная лабораторная процедура.

Преобразование с использованием электропорация был разработан в конце 1980-х годов, повысив эффективность трансформации in vitro и увеличив количество бактериальные штаммы это могло быть преобразовано.[9] Трансформация клеток животных и растений также была исследована с помощью первых трансгенная мышь был создан путем инъекции гена гормона роста крысы эмбриону мыши в 1982 году.[10] В 1907 году бактерия, вызвавшая опухоли растений, Agrobacterium tumefaciens, было обнаружено, и в начале 1970-х было обнаружено, что агент, вызывающий опухоль, представляет собой ДНК плазмида называется Плазмида Ti.[11] Удалив гены в плазмиде, вызвавшие опухоль, и добавив новые гены, исследователи смогли инфицировать растения А. tumefaciens и позвольте бактериям вставить выбранную ими ДНК в геномы растений.[12] Не все клетки растений восприимчивы к заражению А. tumefaciens, поэтому были разработаны другие методы, в том числе электропорация и микроинъекция.[13] Бомбардировка частицами стала возможной с изобретением Система доставки биологических частиц (генная пушка) Джон Сэнфорд в 1980-е гг.[14][15][16]

Определения

Трансформация - одна из трех форм горизонтальный перенос генов которые встречаются в природе среди бактерий, у которых ДНК, кодирующая признак, передается от одной бактерии к другой и интегрируется в геном реципиента посредством гомологичная рекомбинация; два других трансдукция, осуществляемый с помощью бактериофаг, и спряжение, в котором ген передается через прямой контакт между бактериями.[1] При трансформации генетический материал проходит через промежуточную среду, и поглощение полностью зависит от бактерии-реципиента.[1]

Компетентность относится к временному состоянию способности поглощать экзогенную ДНК из окружающей среды; это может быть вызвано в лаборатории.[1]

Похоже, что это древний процесс, унаследованный от общего прокариотического предка, который является полезной адаптацией для содействия рекомбинационной репарации повреждений ДНК, особенно повреждений, приобретенных в стрессовых условиях. Естественная генетическая трансформация, по-видимому, является адаптацией к восстановлению повреждений ДНК, которые также вызывают генетическое разнообразие.[1][17]

Трансформация была изучена в важных с медицинской точки зрения Грамотрицательные бактерии такие виды, как Helicobacter pylori, Легионелла пневмофила, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae и Холерный вибрион.[18] Он также был изучен на грамотрицательных видах, обнаруженных в почве, таких как Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter baylyi, и грамотрицательные патогены растений Такие как Ralstonia solanacearum и Xylella fastidiosa.[18] Преобразование среди Грамположительные бактерии был изучен у важных с медицинской точки зрения видов, таких как Пневмококк, Streptococcus mutans, Золотистый стафилококк и Streptococcus sanguinis и в грамположительных почвенных бактериях Bacillus subtilis.[17] Также сообщалось, что по крайней мере у 30 видов Протеобактерии распределены по классам альфа, бета, гамма и эпсилон.[19] Лучше всего изучен Протеобактерии в отношении трансформации - важные с медицинской точки зрения патогены человека Neisseria gonorrhoeae (класс бета), Haemophilus influenzae (гамма класса) и Helicobacter pylori (класс эпсилон)[17]

«Трансформация» может также использоваться для описания внедрения нового генетического материала в небактериальные клетки, включая клетки животных и растений; однако, поскольку "трансформация «имеет особое значение по отношению к животным клеткам, указывая на прогрессирование до ракового состояния, этот процесс обычно называется»трансфекция ".[2]

Естественная компетентность и трансформация

Основная статья: Естественная компетентность

На 2014 год было известно около 80 видов бактерий, способных к трансформации, примерно поровну разделенных между Грамположительный и Грамотрицательные бактерии; это число может быть завышенным, поскольку некоторые отчеты поддерживаются отдельными документами.[1]

Естественно компетентные бактерии несут наборы генов, которые обеспечивают белковый аппарат для переноса ДНК через клеточную мембрану (и). Для транспорта экзогенной ДНК в клетки могут потребоваться белки, которые участвуют в сборке пили IV типа и система секреции типа II, а также ДНК транслоказа комплекс на цитоплазматической мембране.[20]

Из-за различий в структуре клеточной оболочки грамположительных и грамотрицательных бактерий существуют некоторые различия в механизмах захвата ДНК этими клетками, однако большинство из них имеют общие черты, связанные с родственными белками. ДНК сначала связывается с поверхностью компетентных клеток на рецепторе ДНК и проходит через цитоплазматическая мембрана через ДНК-транслоказу.[21] Может проходить только одноцепочечная ДНК, при этом другая цепь разрушается нуклеазами. Затем транслоцированная одноцепочечная ДНК может быть интегрирована в бактериальные хромосомы посредством RecA -зависимый процесс. В грамотрицательных клетках из-за наличия дополнительной мембраны ДНК требует наличия канала, образованного секретинами на внешней мембране. Пилин может потребоваться для компетентности, но его роль неясна.[22] Поглощение ДНК обычно неспецифично для последовательности, хотя у некоторых видов присутствие конкретных последовательностей захвата ДНК может способствовать эффективному захвату ДНК.[23]

Естественная трансформация

Естественная трансформация - это бактериальная адаптация к переносу ДНК, которая зависит от экспрессии многочисленных бактериальных генов, продукты которых, по-видимому, ответственны за этот процесс.[20][19] В целом трансформация - это сложный, энергоемкий процесс развития. Чтобы бактерия могла связывать, захватывать и рекомбинировать экзогенную ДНК в свою хромосому, она должна стать компетентной, то есть войти в особое физиологическое состояние. Развитие компетенций в Bacillus subtilis требует экспрессии около 40 генов.[24] ДНК, интегрированная в хромосому хозяина, обычно (но за редкими исключениями) происходит от другой бактерии того же вида и, таким образом, гомологична резидентной хромосоме.

В Б. subtilis длина перенесенной ДНК превышает 1271 т.п.н. (более 1 миллиона оснований).[25] Переносимая длина, вероятно, представляет собой двухцепочечную ДНК и часто составляет более трети общей длины хромосомы в 4215 т.п.н.[26] Похоже, что около 7-9% реципиентных клеток занимают всю хромосому.[27]

Способность к естественной трансформации проявляется у ряда прокариот, и на сегодняшний день известно, что 67 видов прокариот (в семи различных типах) подвергаются этому процессу.[19]

Компетентность к трансформации обычно индуцируется высокой плотностью клеток и / или ограничением питания, условиями, связанными со стационарной фазой роста бактерий. Преобразование в Haemophilus influenzae наиболее эффективно происходит в конце экспоненциального роста, когда рост бактерий приближается к стационарной фазе.[28] Преобразование в Streptococcus mutans, как и во многих других стрептококках, встречается с высокой плотностью клеток и связан с биопленка формирование.[29] Компетентность в Б. subtilis индуцируется к концу логарифмического роста, особенно в условиях ограничения аминокислот.[30] Аналогичным образом в Micrococcus luteus (представитель менее изученных Актинобактерии phylum) компетентность развивается во время средне-поздней фазы экспоненциального роста, а также запускается аминокислотным голоданием.[31][32]

Высвобождая интактную ДНК хозяина и плазмиды, некоторые бактериофаги считаются способствующими трансформации.[33]

Трансформация как адаптация к репарации ДНК

Компетентность специфически индуцируется условиями повреждения ДНК. Например, преобразование индуцируется в Пневмококк повреждающими ДНК агентами митомицином С (агент сшивания ДНК) и фторхинолоном (ингибитор топоизомеразы, вызывающий двухцепочечные разрывы).[34] В Б. subtilisтрансформация усиливается УФ-светом, агентом, повреждающим ДНК.[35] В Helicobacter pylori, ципрофлоксацин, который взаимодействует с ДНК-гиразой и вызывает двухцепочечные разрывы, индуцирует экспрессию генов компетенции, тем самым увеличивая частоту трансформации[36] С помощью Легионелла пневмофила, Charpentier et al.[37] протестировали 64 токсичных молекулы, чтобы определить, какие из них вызывают компетентность. Из них только шесть агентов, повреждающих ДНК, вызывали сильную индукцию. Эти повреждающие ДНК агенты представляли собой митомицин С (который вызывает межцепочечные сшивки ДНК), норфлоксацин, офлоксацин и налидиксовая кислота (ингибиторы ДНК-гиразы, вызывающие двухцепочечные разрывы).[38]), бицикломицин (вызывает разрывы одно- и двухцепочечных[39]) и гидроксимочевина (вызывает окисление оснований ДНК[40]). Ультрафиолетовый свет также стимулировал компетентность в L. pneumophila. Charpentier et al.[37] предположили, что способность к трансформации, вероятно, возникла как реакция на повреждение ДНК.

Логарифмически растущие бактерии отличаются от бактерий стационарной фазы количеством копий генома, присутствующих в клетке, и это имеет значение для способности выполнять важную задачу. Ремонт ДНК процесс. Во время логарифмического роста в бактериальной клетке могут присутствовать две или более копий любой конкретной области хромосомы, поскольку деление клетки не точно совпадает с репликацией хромосомы. Процесс гомологичной рекомбинационной репарации (HRR) - это ключевой процесс репарации ДНК, который особенно эффективен для восстановления двухцепочечных повреждений, таких как двухцепочечные разрывы. Этот процесс зависит от второй гомологичной хромосомы в дополнение к поврежденной хромосоме. Во время логарифмического роста повреждение ДНК в одной хромосоме может быть восстановлено с помощью HRR с использованием информации о последовательности из другой гомологичной хромосомы. Однако, когда клетки достигают стационарной фазы, они обычно имеют только одну копию хромосомы, и HRR требует ввода гомологичного шаблона извне клетки путем трансформации.[41]

Чтобы проверить, является ли адаптивная функция трансформации репарацией повреждений ДНК, была проведена серия экспериментов с использованием Б. subtilis облучение УФ-светом в качестве повреждающего агента (обзор Michod et al.[42] и Bernstein et al.[41]Результаты этих экспериментов показали, что трансформация ДНК действует для восстановления потенциально летальных повреждений ДНК, вызванных УФ-светом в ДНК реципиента. Конкретный процесс, ответственный за ремонт, вероятно, был HRR. Трансформацию у бактерий можно рассматривать как примитивный половой процесс, поскольку он включает взаимодействие гомологичной ДНК двух индивидуумов с образованием рекомбинантной ДНК, которая передается последующим поколениям. Бактериальная трансформация у прокариот могла быть наследственным процессом, который привел к мейотическому половому размножению у эукариот (см. Эволюция полового размножения; Мейоз.)

Методы и механизмы трансформации в лаборатории

Схема бактериальной трансформации, для которой сначала необходимо вызвать искусственную компетентность.

Бактериальный

Искусственная компетентность может быть вызвана лабораторными процедурами, которые включают в себя создание пассивной проницаемости клетки для ДНК путем воздействия на нее условий, которые обычно не встречаются в природе.[43] Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащем двухвалентный катионы (довольно часто хлорид кальция ) в холодных условиях, до воздействия теплового импульса (теплового шока). Хлорид кальция частично разрушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникать в клетку-хозяин. Клетки, способные принимать ДНК, называются компетентными клетками.

Было обнаружено, что рост грамотрицательных бактерий в 20 мМ Mg снижает количество белков, превращающих их влипополисахарид связывает за счет увеличения отношения ионных и ковалентных связей, что увеличивает текучесть мембраны, облегчая трансформацию.[44] Роль липополисахаридов здесь подтверждается наблюдением, что более короткие O-боковые цепи трансформируются более эффективно - возможно, из-за улучшенной доступности ДНК.

Поверхность бактерий, таких как Кишечная палочка заряжен отрицательно из-за фосфолипиды и липополисахариды на его клеточной поверхности, и ДНК также заряжена отрицательно. Таким образом, одна из функций двухвалентного катиона - защищать заряды путем координации фосфатных групп и других отрицательных зарядов, тем самым позволяя молекуле ДНК прикрепляться к поверхности клетки.

Вхождение ДНК в Кишечная палочка Ячейки проходят через каналы, известные как зоны адгезии или соединения Байера, при этом типичная ячейка несет до 400 таких зон. Их роль была установлена, когда кобаламин (который также использует эти каналы), как было обнаружено, конкурентно ингибирует захват ДНК. Другой тип канала, участвующего в захвате ДНК, состоит из поли (HB): поли P: Ca. Предполагается, что в этом случае поли (HB) оборачивается вокруг ДНК (которая сама по себе является полифосфатом) и находится в щите, образованном ионами Са.[44]

Предполагается, что воздействие на клетки двухвалентных катионов в холодных условиях может также изменить или ослабить структуру поверхности клетки, сделав ее более проницаемой для ДНК. Считается, что тепловой импульс создает тепловой дисбаланс на клеточной мембране, который заставляет ДНК проникать в клетки либо через клеточные поры, либо через поврежденную клеточную стенку.

Электропорация это еще один метод повышения компетентности. В этом методе клетки кратковременно сотрясаются электрическим током. электрическое поле из 10-20 кВ / см, который, как считается, создает отверстия в клеточной мембране, через которые может проникать плазмидная ДНК. После поражения электрическим током отверстия быстро закрываются механизмами восстановления мембраны клетки.

Дрожжи

Большинство видов дрожжи, включая Saccharomyces cerevisiae, может быть трансформирована экзогенной ДНК в окружающей среде. Было разработано несколько методов, облегчающих это преобразование с высокой частотой в лаборатории.[45]

  • Клетки дрожжей можно обрабатывать ферментами для разрушения их клеточных стенок, в результате чего получают сферопласты. Эти клетки очень хрупкие, но очень быстро поглощают чужеродную ДНК.[46]
  • Воздействие на неповрежденные дрожжевые клетки щелочь катионы такие как у цезий или же литий позволяет клеткам принимать плазмидную ДНК.[47] Более поздние протоколы адаптировали этот метод преобразования, используя лития ацетат, полиэтиленгликоль, и одноцепочечная ДНК.[48] В этих протоколах одноцепочечная ДНК предпочтительно связывается со стенкой дрожжевых клеток, предотвращая это от плазмидной ДНК и оставляя ее доступной для трансформации.[49]
  • Электропорация: Формирование переходных дыр в клеточных мембранах с помощью электрического шока; это позволяет ДНК проникать, как описано выше для бактерий.[50]
  • Ферментативное пищеварение[51] или взбалтывание стеклянными бусами[52] также можно использовать для трансформации дрожжевых клеток.

Эффективность - Различные роды и виды дрожжей поглощают чужеродную ДНК с разной эффективностью.[53] Кроме того, большинство протоколов трансформации было разработано для пекарских дрожжей, С. cerevisiae, и поэтому не может быть оптимальным для других видов. Даже в пределах одного вида разные штаммы обладают разной эффективностью трансформации, иногда различающейся на три порядка. Например, когда штаммы S. cerevisiae трансформировали 10 мкг плазмиды YEp13, штамм DKD-5D-H давал от 550 до 3115 колоний, тогда как штамм OS1 давал менее пяти колоний.[54]

Растения

Доступен ряд методов для переноса ДНК в клетки растений. Немного вектор -опосредованными методами являются:

  • Агробактерии -опосредованная трансформация - это самая легкая и простая трансформация растений. Ткань растений (часто листья) разрезают на мелкие кусочки, например 10х10 мм и замочили на десять минут в жидкости, содержащей взвешенные Агробактерии. Бактерии прикрепляются ко многим растительным клеткам, обнаженным при разрезе. Клетки растений выделяют связанные с раной фенольные соединения, которые, в свою очередь, активизируют оперон вирулентности Agrobacterium. Оперон вирулентности включает в себя множество генов, которые кодируют белки, которые являются частью системы секреции типа IV, которая экспортируется из белков и ДНК бактерий (обозначенных специфическими мотивами распознавания, называемыми пограничными последовательностями, и вырезанных в виде одной цепи из плазмиды вирулентности) в растение. клетка через структуру, называемую пилусом. Перенесенная ДНК (называемая Т-ДНК) направляется в ядро ​​растительной клетки с помощью сигналов ядерной локализации, присутствующих в белке VirD2 Agrobacterium, который ковалентно прикреплен к концу Т-ДНК на правой границе (RB). Как именно Т-ДНК интегрируется в геномную ДНК растения-хозяина, является активной областью исследований биологии растений. Предполагая, что маркер селекции (такой как ген устойчивости к антибиотикам) был включен в Т-ДНК, трансформированную растительную ткань можно культивировать на селективной среде для получения побегов. Затем побеги переносят в другую среду, чтобы способствовать формированию корней. Как только корни трансгенного побега начинают прорастать, растения можно переносить в почву для завершения нормального жизненного цикла (создания семян). Семена этого первого растения (называемого T1, для первого трансгенного поколения) могут быть посажены на селективном (содержащем антибиотик), или, если был использован ген устойчивости к гербицидам, в качестве альтернативы могут быть посажены в почву, а затем обработаны гербицидом для убивать сегрегантов дикого типа. Некоторые виды растений, такие как Arabidopsis thaliana можно превратить, окунув цветы или все растение в суспензию Agrobacterium tumefaciens, как правило, штамм C58 (C = Cherry, 58 = 1958, год, когда этот конкретный штамм А. tumefaciens был выделен из вишневого дерева в саду Корнельского университета в Итаке, Нью-Йорк). Хотя многие растения остаются невосприимчивыми к трансформации этим методом, продолжаются исследования, которые продолжают добавлять в список виды, которые были успешно модифицированы таким образом.
  • Вирусная трансформация (трансдукция ): Упакуйте желаемый генетический материал в подходящий растительный вирус и позвольте этому модифицированному вирусу заразить растение. Если генетический материал представляет собой ДНК, он может рекомбинировать с хромосомами с образованием трансформантных клеток. Однако геномы большинства вирусов растений состоят из одноцепочечных РНК который реплицируется в цитоплазме инфицированной клетки. Для таких геномов этот метод является формой трансфекция и не настоящая трансформация, поскольку вставленные гены никогда не достигают ядра клетки и не интегрируются в геном хозяина. Потомство инфицированных растений не содержит вирусов и встроенного гена.

Некоторые безвекторные методы включают:

  • Генная пушка: Также называется бомбардировкой частицами, бомбардировкой микрочастицами или биолистикой. Частицы золота или вольфрама покрываются ДНК, а затем попадают в молодые клетки растений или зародыши растений. Некоторый генетический материал останется в клетках и трансформирует их. Этот метод также позволяет трансформировать пластиды растений. В эффективность трансформации ниже, чем в Агробактерииопосредованная трансформация, но с помощью этого метода можно трансформировать большинство растений.
  • Электропорация: Формирование переходных отверстий в клеточных мембранах с помощью электрических импульсов высокой напряженности поля; это позволяет ДНК проникать, как описано выше для бактерий.[55]

Грибы

Есть несколько методов получения трансгенных грибы большинство из них аналогичны тем, которые используются для растений. Однако к грибам нужно относиться по-другому из-за некоторых их микроскопических и биохимических особенностей:

  • Основная проблема - это дикариотическое состояние что части некоторых грибов находятся в; дикариотические клетки содержат два гаплоидных ядра, по одному от каждого родительского гриба. Если трансформируется только одно из них, что является правилом, процент трансформированных ядер уменьшается после каждого спороношение.[56]
  • Стенки грибковых клеток довольно толстые, что препятствует захвату ДНК, поэтому часто требуется (частичное) удаление;[57] полная деградация, которая иногда необходима,[56] дает протопласты.
  • Мицелиальные грибы состоят из нитчатых гифы, которые, если вообще разделены внутренними клеточными стенками, прерванными порами, достаточно большими, чтобы питательные вещества и органеллы, иногда даже ядра, могли проходить через каждую гифу. В результате отдельные клетки обычно не могут быть разделены. Это проблематично, поскольку соседние трансформированные клетки могут сделать нетрансформированные клетки невосприимчивыми к селекционным методам лечения, например путем доставки питательных веществ или белков для устойчивости к антибиотикам.[56]
  • Кроме того, рост (и, следовательно, митоз) этих грибов происходит исключительно на кончике их гиф, что также может вызывать проблемы.[56]

Как указывалось ранее, ряд методов, используемых для трансформации растений, также работает с грибами:

  • Agrobacterium способны инфицировать не только растения, но и грибы, однако, в отличие от растений, грибы не выделяют фенольные соединения, необходимые для запуска Agrobacterium, поэтому их нужно добавлять, например, в виде ацетосирингон.[56]
  • Благодаря развитию системы экспрессии малых РНК в грибах введение CRISPR / CAS9-система в грибковых клетках.[56] В 2016 году Министерство сельского хозяйства США объявило, что не будет регулировать штамм белого шампиньона, отредактированный с помощью CRISPR / CAS9, чтобы предотвратить потемнение плодовых тел, вызвав широкую дискуссию о размещении на рынке культур с редактированием CRISPR / CAS9.[58]
  • Физические методы, такие как электропорация, биолистика («генная пушка»), сонопорация который использует кавитацию пузырьков газа, создаваемых ультразвуком для проникновения через клеточную мембрану, и т. д., также применимы к грибам.[59]

Животные

Введение ДНК в клетки животных обычно называют трансфекция, и обсуждается в соответствующей статье.

Практические аспекты трансформации в молекулярной биологии

Дальнейшая информация: Эффективность трансформации

Открытие искусственно вызванной компетентности у бактерий позволило бактериям, таким как кишечная палочка для использования в качестве удобного хозяина для манипуляций с ДНК, а также для экспрессии белков. Обычно плазмиды используются для трансформации в Кишечная палочка. Для стабильного сохранения в клетке молекула плазмидной ДНК должна содержать начало репликации, что позволяет ему реплицироваться в клетке независимо от репликации собственной хромосомы клетки.

Эффективность, с которой компетентная культура может поглощать экзогенную ДНК и экспрессировать ее гены, известна как эффективность трансформации и измеряется в колониеобразующих единицах (КОЕ) на мкг используемой ДНК. Эффективность преобразования 1 × 108 КОЕ / мкг для небольшой плазмиды, подобной pUC19 примерно соответствует 1 из 2000 молекул трансформируемой плазмиды.

В превращение хлорида кальция, клетки получают путем охлаждения клеток в присутствии Ca2+
 (в CaCl
2 раствор), делая клетку проницаемой для плазмидная ДНК. Клетки инкубируют на льду с ДНК, а затем подвергают кратковременному тепловому шоку (например, при 42 ° C в течение 30–120 секунд). Этот метод очень хорошо работает для кольцевой плазмидной ДНК. Некоммерческие препараты обычно должны давать 106 до 107 трансформантов на микрограмм плазмиды; плохая подготовка будет около 104/ мкг или меньше, но хороший препарат компетентных клеток может дать до ~ 108 колоний на микрограмм плазмиды.[60] Однако существуют протоколы для создания суперкомпетентных клеток, которые могут дать эффективность трансформации более 109.[61] Однако химический метод обычно не работает с линейной ДНК, такой как фрагменты хромосомной ДНК, вероятно, потому, что природная клетка экзонуклеаза ферменты быстро разрушают линейную ДНК. Напротив, естественно компетентные клетки обычно более эффективно трансформируются линейной ДНК, чем плазмидной ДНК.

Эффективность трансформации с использованием CaCl
2 Метод уменьшается с размером плазмиды, поэтому электропорация может быть более эффективным методом захвата большой плазмидной ДНК.[62] Клетки, используемые в электропорации, следует сначала подготовить путем промывки в холодной бидистиллированной воде для удаления заряженных частиц, которые могут создавать искры в процессе электропорации.

Отбор и скрининг при трансформации плазмид

Поскольку трансформация обычно дает смесь относительно небольшого числа трансформированных клеток и большого количества нетрансформированных клеток, необходим метод отбора клеток, которые приобрели плазмиду.[63] Следовательно, плазмиде требуется выбираемый маркер так что эти клетки без плазмиды могут быть убиты или их рост может быть остановлен. Устойчивость к антибиотикам является наиболее часто используемым маркером для прокариот. Трансформирующая плазмида содержит ген, придающий устойчивость к антибиотику, к которому бактерии в остальном чувствительны. Смесь обработанных клеток культивируют в среде, содержащей антибиотик, так что только трансформированные клетки могут расти. Другой метод выбора - использование определенных ауксотрофный маркеры, которые могут компенсировать неспособность метаболизировать определенные аминокислоты, нуклеотиды или сахара. Этот метод требует использования подходящих мутированных штаммов, которые недостаточны для синтеза или полезности конкретной биомолекулы, и трансформированные клетки культивируются в среде, которая позволяет расти только клеткам, содержащим плазмиду.

В эксперименте по клонированию ген может быть вставлен в плазмиду, используемую для трансформации. Однако в таком эксперименте не все плазмиды могут содержать успешно вставленный ген. Следовательно, могут быть использованы дополнительные методы для скрининга трансформированных клеток, содержащих плазмиду со вставкой. Репортерные гены может использоваться как маркеры, такой как lacZ ген, который кодирует β-галактозидаза используется в сине-белый экран. Этот метод скрининга основан на принципе α-дополнение, где фрагмент lacZ ген (lacZα) в плазмиде может дополнять другой мутант lacZ ген (lacZΔM15) в ячейке. Оба гена сами по себе продуцируют нефункциональные пептиды, однако при совместной экспрессии, как если бы плазмида, содержащая lacZ-α превращается в lacZΔM15 клетки они образуют функциональную β-галактозидазу. Присутствие активной β-галактозидазы может быть обнаружено при выращивании клеток в чашках, содержащих X-gal, образующие характерные синие колонии. Тем не менее сайт множественного клонирования, где интересующий ген может быть перевязанный в плазмиду вектор, находится в lacZα ген. Таким образом, успешное лигирование нарушает lacZα гена, и функциональная β-галактозидаза не может образовываться, что приводит к образованию белых колоний. Затем клетки, содержащие успешно лигированную вставку, можно легко отличить по ее белой окраске от неудачных синих.

Другие часто используемые репортерные гены: зеленый флуоресцентный белок (GFP), который производит клетки, которые светятся зеленым в синем свете, а фермент люцифераза, который катализирует реакцию с люциферин излучать свет. Рекомбинантная ДНК также может быть обнаружена с использованием других методов, таких как гибридизация нуклеиновой кислоты с радиоактивным РНК-зондом, в то время как клетки, экспрессирующие желаемый белок из плазмиды, также могут быть обнаружены с использованием иммунологических методов.

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я Джонстон К., Мартин Б., Фичант Дж., Полард П., Клаверис Дж. П. (март 2014 г.). «Бактериальная трансформация: распространение, общие механизмы и дивергентный контроль». Обзоры природы. Микробиология. 12 (3): 181–96. Дои:10.1038 / nrmicro3199. PMID  24509783. S2CID  23559881.
  2. ^ а б Альбертс Б, Джонсон А., Льюис Дж, Рафф М., Робертс К., Уолтер П. (2002). Молекулярная биология клетки. Нью-Йорк: Наука Гарланд. п. Г: 35. ISBN  978-0-8153-4072-0.
  3. ^ Гриффит Ф (1928). «Значение типов пневмококков». Журнал гигиены. 27 (2): 113–59. Дои:10.1017 / s0022172400031879. ЧВК  2167760. PMID  20474956.
  4. ^ Кейс, Кристина; Funke, Berdell; Тортора, Жерар. Введение в микробиологию (десятое издание)
  5. ^ Ледерберг, Джошуа (1994). "Трансформация генетики с помощью ДНК: празднование годовщины АВЕРИ, МАКЛЕОДА и МАККАРТИ (1944) в Анекдотические, исторические и критические комментарии по генетике". Генетика. 136 (2): 423–6. ЧВК  1205797. PMID  8150273.
  6. ^ Мандель М, Хига А (октябрь 1970 г.). «Кальций-зависимая ДНК-инфекция бактериофага». Журнал молекулярной биологии. 53 (1): 159–62. Дои:10.1016/0022-2836(70)90051-3. PMID  4922220.
  7. ^ Коэн С.Н., Чанг А.С., Сюй Л. (август 1972 г.). «Нехромосомная устойчивость бактерий к антибиотикам: генетическая трансформация Escherichia coli ДНК R-фактора». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 69 (8): 2110–4. Bibcode:1972PNAS ... 69.2110C. Дои:10.1073 / pnas.69.8.2110. ЧВК  426879. PMID  4559594.
  8. ^ Ханахан Д. (июнь 1983 г.). «Исследования по трансформации Escherichia coli плазмидами». Журнал молекулярной биологии. 166 (4): 557–80. CiteSeerX  10.1.1.460.2021. Дои:10.1016 / S0022-2836 (83) 80284-8. PMID  6345791.
  9. ^ Вирт Р., Фризенеггер А., Фидлер С. (март 1989 г.). «Трансформация различных видов грамотрицательных бактерий, принадлежащих к 11 различным родам, путем электропорации». Молекулярная и общая генетика. 216 (1): 175–7. Дои:10.1007 / BF00332248. PMID  2659971. S2CID  25214157.
  10. ^ Пальмитер Р.Д., Бринстер Р.Л., Хаммер Р.Э., Трумбауэр М.Э., Розенфельд М.Г., Бирнберг Н.С., Эванс Р.М. (декабрь 1982 г.). «Резкий рост мышей, которые развиваются из яиц с микроинъекцией генов слияния металлотионеина и гормона роста». Природа. 300 (5893): 611–5. Bibcode:1982Натура.300..611П. Дои:10.1038 / 300611a0. ЧВК  4881848. PMID  6958982.
  11. ^ Нестер, Евгений. "Agrobacterium: естественный генетик (100 лет спустя)". APS. Американское фитопатологическое общество. Получено 14 января 2011.
  12. ^ Zambryski P, Joos H, Genetello C, Leemans J, Montagu MV, Schell J (1983). «Плазмидный вектор Ti для введения ДНК в клетки растений без изменения их нормальной способности к регенерации». Журнал EMBO. 2 (12): 2143–50. Дои:10.1002 / j.1460-2075.1983.tb01715.x. ЧВК  555426. PMID  16453482.
  13. ^ Питерс, Памела. «Трансформация растений - основные методы генной инженерии». Доступ к совершенству. Получено 28 января 2010.
  14. ^ «Биологи изобрели пистолет для стрельбы по клеткам ДНК» (PDF). Корнельская хроника. 14 мая 1987 г. с. 3.
  15. ^ Sanford JC, Klein TM, Wolf ED, Allen N (1987). «Доставка веществ в клетки и ткани с использованием процесса бомбардировки частицами». Журнал науки о частицах и технологиях. 5: 27–37. Дои:10.1080/02726358708904533.
  16. ^ Кляйн Р.М., Вольф ED, Ву Р., Сэнфорд Дж. К. (1992). «Высокоскоростные микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки. 1987». Биотехнология (Ридинг, Массачусетс). 24: 384–6. PMID  1422046.
  17. ^ а б c Мичод Р.Э., Бернштейн Х., Недельку А.М. (май 2008 г.). «Адаптивное значение секса у микробных патогенов». Инфекция, генетика и эволюция. 8 (3): 267–85. Дои:10.1016 / j.meegid.2008.01.002. PMID  18295550.
  18. ^ а б Зейтц П., Блокеш М. (май 2013 г.). «Сигналы и регуляторные пути, участвующие в естественной компетентности и трансформации патогенных и экологических грамотрицательных бактерий» (PDF). Обзор микробиологии FEMS. 37 (3): 336–63. Дои:10.1111 / j.1574-6976.2012.00353.x. PMID  22928673.
  19. ^ а б c Johnsborg O, Eldholm V, Håvarstein LS (декабрь 2007 г.). «Естественная генетическая трансформация: распространенность, механизмы и функции». Исследования в области микробиологии. 158 (10): 767–78. Дои:10.1016 / j.resmic.2007.09.004. PMID  17997281.
  20. ^ а б Чен И., Дубнау Д. (март 2004 г.). «Поглощение ДНК во время бактериальной трансформации». Обзоры природы. Микробиология. 2 (3): 241–9. Дои:10.1038 / nrmicro844. PMID  15083159. S2CID  205499369.
  21. ^ Lacks S, Greenberg B, Neuberger M (июнь 1974 г.). «Роль дезоксирибонуклеазы в генетической трансформации Diplococcus pneumoniae». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 71 (6): 2305–9. Bibcode:1974PNAS ... 71.2305L. Дои:10.1073 / пнас.71.6.2305. ЧВК  388441. PMID  4152205.
  22. ^ Длинный компакт-диск, Tobiason DM, Lazio MP, Kline KA, Seifert HS (ноябрь 2003 г.). «Низкий уровень экспрессии пилина обеспечивает существенную способность к трансформации ДНК у Neisseria gonorrhoeae». Инфекция и иммунитет. 71 (11): 6279–91. Дои:10.1128 / iai.71.11.6279-6291.2003. ЧВК  219589. PMID  14573647.
  23. ^ Сиско К.Л., Смит Х.О. (февраль 1979 г.). «Захват ДНК, специфичный для последовательности, при трансформации Haemophilus». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 76 (2): 972–6. Bibcode:1979ПНАС ... 76..972С. Дои:10.1073 / pnas.76.2.972. ЧВК  383110. PMID  311478.
  24. ^ Соломон Дж. М., Гроссман А. Д. (апрель 1996 г.). «Кто и когда компетентен: регуляция естественной генетической компетентности бактерий». Тенденции в генетике. 12 (4): 150–5. Дои:10.1016/0168-9525(96)10014-7. PMID  8901420.
  25. ^ Сайто Й., Тагучи Х., Акамацу Т. (март 2006 г.). «Судьба трансформации бактериального генома после включения в компетентные клетки Bacillus subtilis: непрерывная длина встроенной ДНК». Журнал биологии и биоинженерии. 101 (3): 257–62. Дои:10.1263 / jbb.101.257. PMID  16716928.
  26. ^ Сайто Й, Тагучи Х, Акамацу Т (апрель 2006 г.). «ДНК, введенная в компетентные клетки Bacillus subtilis путем трансформации лизированного протопласта, является не оцДНК, а дцДНК». Журнал биологии и биоинженерии. 101 (4): 334–9. Дои:10.1263 / jbb.101.334. PMID  16716942.
  27. ^ Акамацу Т., Тагучи Х (апрель 2001 г.). «Включение всей хромосомной ДНК в лизаты протопластов в компетентные клетки Bacillus subtilis». Биология, биотехнология и биохимия. 65 (4): 823–9. Дои:10.1271 / bbb.65.823. PMID  11388459. S2CID  30118947.
  28. ^ Goodgal SH, Herriott RM (июль 1961 г.). «Исследования трансформации Hemophilus influenzae. I. Компетентность». Журнал общей физиологии. 44 (6): 1201–27. Дои:10.1085 / jgp.44.6.1201. ЧВК  2195138. PMID  13707010.
  29. ^ Аспирас МБ, Эллен Р.П., Цветкович Д.Г. (сентябрь 2004 г.). «Комплексная активность Streptococcus mutans, растущих в биопленках». Письма о микробиологии FEMS. 238 (1): 167–74. Дои:10.1016 / j.femsle.2004.07.032. PMID  15336418.
  30. ^ Анагностопулос С., Спизизен Дж. (Май 1961 г.). «Требования к трансформации у Bacillus Subtilis». Журнал бактериологии. 81 (5): 741–6. Дои:10.1128 / JB.81.5.741-746.1961. ЧВК  279084. PMID  16561900.
  31. ^ Ангелов, Ангел; Берген, Пол; Надлер, Флориан; Хорнбург, Филипп; Личев, Антони; Œbelacker, Мария; Пахл, Фиона; Кустер, Бернхард; Либль, Вольфганг (10 февраля 2015 г.). «Новая естественная трансформация, зависящая от биогенеза пилуса Flp». Границы микробиологии. 6: 84. Дои:10.3389 / fmicb.2015.00084. ЧВК  4322843. PMID  25713572.
  32. ^ Личев, Антони; Ангелов, Ангел; Кукурулл, Иниго; Либль, Вольфганг (30 июля 2019 г.). «Аминокислоты как факторы питания и (p) ppGpp как сигнализатор строгой реакции регулируют естественную трансформацию Micrococcus luteus». Научные отчеты. 9 (1): 11030. Bibcode:2019НатСР ... 911030Л. Дои:10.1038 / с41598-019-47423-х. ЧВК  6667448. PMID  31363120.
  33. ^ Кин Э.С., Блисковский В.В., Малагон Ф., Бейкер Дж. Д., Принц Дж. С., Клаус Дж. С., Adhya SL (январь 2017 г.). "Роман" Суперпредседатель "Бактериофаги способствуют горизонтальному переносу генов путем трансформации". мБио. 8 (1): e02115–16. Дои:10,1128 / мБио.02115-16. ЧВК  5241400. PMID  28096488.
  34. ^ Клаверис Дж. П., Прюдом М, Мартин Б. (2006). «Индукция регулонов компетенции как общий ответ на стресс у грамположительных бактерий». Ежегодный обзор микробиологии. 60: 451–75. Дои:10.1146 / annurev.micro.60.080805.142139. PMID  16771651.
  35. ^ Michod RE, Wojciechowski MF, Hoelzer MA (январь 1988 г.). «Ремонт ДНК и эволюция трансформации бактерии Bacillus subtilis». Генетика. 118 (1): 31–9. ЧВК  1203263. PMID  8608929.
  36. ^ Дорер М.С., Феро Дж., Салама Н.Р. (июль 2010 г.). Бланке С.Р. (ред.). «Повреждение ДНК запускает генетический обмен в Helicobacter pylori». Патогены PLOS. 6 (7): e1001026. Дои:10.1371 / journal.ppat.1001026. ЧВК  2912397. PMID  20686662.
  37. ^ а б Шарпантье X, Кей Э., Шнайдер Д., Шуман Х.А. (март 2011 г.). «Антибиотики и УФ-излучение способствуют естественной трансформации Legionella pneumophila». Журнал бактериологии. 193 (5): 1114–21. Дои:10.1128 / JB.01146-10. ЧВК  3067580. PMID  21169481.
  38. ^ Альбертини С., Шетелат А.А., Миллер Б., Мустер В., Пуджадас Е., Штробель Р., Гок Е. (июль 1995 г.). «Генотоксичность 17 гиразы и четырех ядов топоизомеразы II млекопитающих в тест-системах для прокариот и эукариот». Мутагенез. 10 (4): 343–51. Дои:10.1093 / mutage / 10.4.343. PMID  7476271.
  39. ^ Washburn RS, Gottesman ME (январь 2011 г.). «Обрыв транскрипции поддерживает целостность хромосомы». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 108 (2): 792–7. Bibcode:2011PNAS..108..792W. Дои:10.1073 / pnas.1009564108. ЧВК  3021005. PMID  21183718.
  40. ^ Сакано К., Оикава С., Хасэгава К., Каваниши С. (ноябрь 2001 г.). «Гидроксимочевина вызывает сайт-специфическое повреждение ДНК за счет образования перекиси водорода и оксида азота». Японский журнал исследований рака. 92 (11): 1166–74. Дои:10.1111 / j.1349-7006.2001.tb02136.x. ЧВК  5926660. PMID  11714440.
  41. ^ а б Бернштейн Х, Бернштейн С, Мишод Р. Э. (2012). «Глава 1: Восстановление ДНК как основная адаптивная функция пола у бактерий и эукариот». В Kimura S, Shimizu S (ред.). Ремонт ДНК: новое исследование. Nova Sci. Publ., Hauppauge, N.Y., с. 1–49. ISBN  978-1-62100-808-8.
  42. ^ Мичод Р.Э., Бернштейн Х., Недельку А.М. (май 2008 г.). «Адаптивное значение секса у микробных возбудителей» (PDF). Инфекция, генетика и эволюция. 8 (3): 267–85. Дои:10.1016 / j.meegid.2008.01.002. PMID  18295550.
  43. ^ Донахью Р.А., Блум FR (июль 1998 г.). «Трансформация большого объема с высокой производительностью химически компетентных клеток» (PDF). Фокус. 20 (2): 54–56. OCLC  12352630.
  44. ^ а б Шривастава С (2013). Генетика бактерий (PDF). Индия: Springer-Verlag. Дои:10.1007/978-81-322-1090-0. ISBN  978-81-322-1089-4. S2CID  35917467.
  45. ^ Каваи С., Хашимото В., Мурата К. (1 ноября 2010 г.). «Трансформация Saccharomyces cerevisiae и других грибов: методы и возможный механизм». Биоинженерные ошибки. 1 (6): 395–403. Дои:10.4161 / bbug.1.6.13257. ЧВК  3056089. PMID  21468206.
  46. ^ Хиннен А., Хикс Дж. Б., Финк Г. Р. (апрель 1978 г.). «Трансформация дрожжей». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 75 (4): 1929–33. Bibcode:1978PNAS ... 75.1929H. Дои:10.1073 / пнас.75.4.1929. ЧВК  392455. PMID  347451.
  47. ^ Ито Х., Фукуда Й., Мурата К., Кимура А. (январь 1983 г.). «Трансформация интактных дрожжевых клеток, обработанных щелочными катионами». Журнал бактериологии. 153 (1): 163–8. Дои:10.1128 / JB.153.1.163-168.1983. ЧВК  217353. PMID  6336730.
  48. ^ Гитц Р. Д., Вудс Р. А. (2002). «Трансформация дрожжей методом ацетата лития / одноцепочечной ДНК-носителя / полиэтиленгликоля». Руководство по генетике дрожжей, молекулярной и клеточной биологии - Часть B. Методы в энзимологии. 350. С. 87–96. Дои:10.1016 / S0076-6879 (02) 50957-5. ISBN  9780121822538. PMID  12073338.
  49. ^ Гитц Р. Д., Шистл Р. Х., Виллемс А. Р., Вудс Р. А. (апрель 1995 г.). «Исследования по трансформации интактных дрожжевых клеток с помощью процедуры LiAc / SS-ДНК / PEG». Дрожжи. 11 (4): 355–60. Дои:10.1002 / год. 320110408. PMID  7785336.
  50. ^ Schiestl, Роберт H .; Manivasakam, P .; Вудс, Робин А .; Гицт, Р. Дэниел (1 августа 1993 г.). «Введение ДНК в дрожжи путем трансформации». Методы. 5 (2): 79–85. Дои:10.1006 / мет.1993.1011.
  51. ^ Спенсер, Ф .; Ketner, G .; Коннелли, С .; Хитер, П. (1 августа 1993 г.). «Целенаправленное клонирование на основе рекомбинации и манипуляции с большими сегментами ДНК в дрожжах». Методы. 5 (2): 161–175. Дои:10.1006 / мет.1993.1021.
  52. ^ Костанцо MC, Fox TD (ноябрь 1988 г.). «Трансформация дрожжей путем перемешивания стеклянными шариками». Генетика. 120 (3): 667–70. ЧВК  1203545. PMID  3066683.
  53. ^ Dohmen RJ, Strasser AW, Höner CB, Hollenberg CP (октябрь 1991 г.). «Эффективная процедура трансформации, позволяющая долгое время хранить компетентные клетки различных родов дрожжей». Дрожжи. 7 (7): 691–2. Дои:10.1002 / год.320070704. PMID  1776359.
  54. ^ Хаяма Й, Фукуда Й, Кавай С., Хашимото В., Мурата К. (2002). «Чрезвычайно простой, быстрый и высокоэффективный метод трансформации дрожжей Saccharomyces cerevisiae с использованием глутатиона и клеток ранней логарифмической фазы». Журнал биологии и биоинженерии. 94 (2): 166–71. Дои:10.1016 / с 1389-1723 (02) 80138-4. PMID  16233287.
  55. ^ В. Сингх и Д. К. Джейн (2014). «Приложения рекомбинантной ДНК». ISC БИОЛОГИЯ. Нагин Пракашан. п. 840.
  56. ^ а б c d е ж Поединок, Н.Л .; Блюм, Я. Б. (март 2018 г.). «Достижения, проблемы и перспективы генетической трансформации грибов». Цитология и генетика. 52 (2): 139–154. Дои:10.3103 / S009545271802007X. ISSN  0095-4527. S2CID  4561837.
  57. ^ Он, Лия; Фэн, Цзяо; Лу, Ша; Чен, Чживэнь; Чен, Чуньмэй; Он, Я; Йи, Сювэнь; Си, Лиянь (2017). «Генетическая трансформация грибов». Международный журнал биологии развития. 61 (6–7): 375–381. Дои:10.1387 / ijdb.160026lh. ISSN  0214-6282. PMID  27528043.
  58. ^ Вальс, Эмили (апрель 2016 г.). "Грибы CRISPR, отредактированные генами, не подлежат регулированию в США". Природа. 532 (7599): 293. Bibcode:2016 Натур.532..293Вт. Дои:10.1038 / природа.2016.19754. ISSN  0028-0836. PMID  27111611.
  59. ^ Ривера, Ана Леонор; Магана-Ортис, Денис; Гомес-Лим, Мигель; Фернандес, Франсиско; Лоське, Ахим М. (июнь 2014 г.). «Физические методы генетической трансформации грибов и дрожжей». Обзоры физики жизни. 11 (2): 184–203. Bibcode:2014ФЛРв..11..184Р. Дои:10.1016 / j.plrev.2014.01.007. PMID  24507729.
  60. ^ Бактериальная трансформация В архиве 2010-06-10 на Wayback Machine
  61. ^ Иноуэ Х, Нодзима Х, Окаяма Х (ноябрь 1990 г.). «Высокоэффективная трансформация Escherichia coli плазмидами». Ген. 96 (1): 23–8. Дои:10.1016 / 0378-1119 (90) 90336-П. PMID  2265755.
  62. ^ Донахью Р.А., Блум FR (сентябрь 1998 г.). «Эффективность трансформации Кишечная палочка электропорация с большой плазмидной ДНК " (PDF). Фокус. 20 (3): 77–78. Архивировано 3 сентября 2011 года.CS1 maint: неподходящий URL (связь)
  63. ^ Birnboim HC, Doly J (ноябрь 1979 г.). «Процедура быстрой щелочной экстракции для скрининга рекомбинантной плазмидной ДНК». Исследования нуклеиновых кислот. 7 (6): 1513–23. Дои:10.1093 / nar / 7.6.1513. ЧВК  342324. PMID  388356.

внешняя ссылка