Трансфекция - Transfection

Смотрите также: Трансфекция РНК и РНК-вакцины

Трансфекция это процесс преднамеренного введения голого или очищенного нуклеиновых кислот в эукариотический клетки.[1][2] Он также может относиться к другим методам и типам ячеек, хотя часто предпочтительны другие термины: "трансформация "обычно используется для описания невирусных ДНК перевод в бактерии и неживотные эукариотический клетки, в том числе клетки растений. В животных клетках трансфекция является предпочтительным термином, поскольку трансформация также используется для обозначения прогрессирования ракового состояния (канцерогенез ) в этих ячейках. Трансдукция часто используется для описания вирусопосредованного переноса гена в эукариотические клетки.[2][3]

Слово трансфекция это чемодан из транс- и инфекция. Генетический материал (например, суперспиральная плазмидная ДНК или миРНК конструкции), или даже белки такие как антитела, могут быть трансфицированы.

Трансфекция клетки животных обычно включает открытие переходных пор или «дыр» в клеточная мембрана чтобы позволить поглощение материала. Трансфекцию можно проводить с помощью фосфат кальция (т.е. трикальцийфосфат ), от электропорация, сдавливанием клеток или смешиванием катионный липид с материалом для производства липосомы которые сливаются с клеточной мембраной и помещают свой груз внутрь.

Трансфекция может привести к неожиданным морфологиям и аномалиям в клетках-мишенях.

Терминология

Значение термина изменилось.[4] Первоначальное значение трансфекции было «заражение путем трансформации», то есть введение генетического материала, ДНК или РНК, из прокариот -инфекционный вирус или бактериофаг в клетки, что приводит к инфекции. Поскольку термин трансформация имеет другое значение в биологии клеток животных (генетическое изменение, позволяющее долгосрочное размножение в культуре или приобретение свойств, типичных для раковых клеток), термин трансфекция приобрел для животных клеток свое нынешнее значение изменения в клетке. свойства, вызванные введением ДНК.

Методы

Существуют различные методы введения иностранных ДНК в эукариот ячейка: некоторые полагаются на физическое лечение (электропорация, сжатие клеток, наночастицы, магнитофекция); другие полагаются на химические материалы или биологические частицы (вирусы), которые используются в качестве носителей. Доставка генов - это, например, один из шагов, необходимых для генная терапия и генетическая модификация сельскохозяйственных культур. Существует множество различных методов доставки генов, разработанных для различных типов клеток и тканей, от бактерий до млекопитающих. В целом методы можно разделить на две категории: невирусные и вирусные.[5]

Невирусные методы включают физические методы, такие как электропорация, микроинъекция, генная пушка, прокол, гидростатическое давление, непрерывная инфузия, обработка ультразвуком и химикаты, такие как липофекция, который представляет собой опосредованный липидами процесс ДНК-трансфекции с использованием липосомных векторов. Он также может включать использование полимерных носителей генов (полиплексов).[6]

Вирус Опосредованная доставка генов использует способность вируса вводить свою ДНК внутрь клетки-хозяина. Ген, который предназначен для доставки, упакован в вирусную частицу с дефицитом репликации. Вирусы, используемые на сегодняшний день, включают ретровирус, лентивирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, и Вирус простого герпеса. Однако есть недостатки в использовании вирусов для доставки генов в клетки. Вирусы могут доставлять в клетки только очень маленькие фрагменты ДНК, это трудозатратно и существует риск случайных участков вставки. цитопатические эффекты и мутагенез.

Бактериальный сферопласты может трансфицировать клетки животных.

Невирусные методы

Трансфекция на химической основе

Трансфекция на химической основе можно разделить на несколько видов: циклодекстрин,[7] полимеры,[8] липосомы или наночастицы[9] (с химической или вирусной функционализацией или без нее. См. ниже).

  • Один из самых дешевых методов использует фосфат кальция, первоначально обнаруженный Ф. Л. Грэм и А. Дж. Ван дер Эб в 1973 г.[10] (смотрите также[11]). HEPES забуференный физиологический раствор (HeBS), содержащий ионы фосфата, комбинируют с хлорид кальция раствор, содержащий ДНК, подлежащую трансфекции. Когда они объединяются, образуется тонкий осадок положительно заряженного кальция и отрицательно заряженного фосфата, связывающий ДНК, подлежащую трансфекции, на ее поверхности. Затем суспензию осадка добавляют к трансфецируемым клеткам (обычно это культура клеток, выращенная в монослое). В результате не совсем понятного процесса клетки поглощают часть осадка, а вместе с ним и ДНК. Этот процесс был предпочтительным методом выявления многих онкогенов.[12]
  • Другой метод - использование катионные полимеры такие как DEAE-декстран или полиэтиленимин (PEI). Отрицательно заряженная ДНК связывается с поликатион и комплекс поглощается клеткой через эндоцитоз.
  • Липофекция (или липосома трансфекция) - это метод, используемый для введения генетического материала в клетку с помощью липосомы, которые пузырьки которые могут легко слиться с клеточная мембрана поскольку они оба сделаны из фосфолипидный бислой.[13] Липофекция обычно использует положительно заряженные (катионный ) липид (катионные липосомы или смеси) с образованием агрегата с отрицательно заряженными (анионный ) генетический материал.[14] Эта технология трансфекции выполняет те же задачи, что и другие биохимические процедуры с использованием полимеров, DEAE-декстран, фосфат кальция, и электропорация. Эффективность липофекции можно повысить, обрабатывая трансфицированные клетки легким тепловой удар.[15]
  • Фуген представляет собой серию широко используемых запатентованных реагентов для нелипосомальной трансфекции, способных напрямую трансфектировать самые разные клетки с высокой эффективностью и низкой токсичностью.[16][17][18][19]
  • Дендример представляет собой класс сильно разветвленных молекул, основанных на различных строительных блоках и синтезированных конвергентным или дивергентным методом. Эти дендримеры связывают нуклеиновые кислоты с образованием дендриплексов, которые затем проникают в клетки.[20][21]

Нехимические методы

Электропоратор с прямоугольными волнами и формами экспоненциального затухания для приложений электропорации in vitro, in vivo, адгезивных клеток и 96-луночных. Изготовлено BTX Harvard Apparatus, Холлистон, Массачусетс, США.
  • Электропорация (генный электроперенос ) - популярный метод, при котором кратковременное увеличение проницаемости клеточной мембраны достигается при воздействии на клетки коротких импульсов сильного электрического поля.
  • Сжатие клеток это метод, изобретенный в 2012 году Армоном Шареи, Роберт Лангер и Клавс Йенсен из Массачусетского технологического института. Он обеспечивает доставку молекул в клетки через деформацию клеточной мембраны. Это безвекторная микрофлюидная платформа с высокой пропускной способностью для внутриклеточной доставки. Он снижает вероятность токсичности или побочных эффектов, поскольку не зависит от экзогенных материалов или электрических полей.[22]
  • Сонопорация использует ультразвук высокой интенсивности, чтобы вызвать порообразование в клеточных мембранах. Это порообразование в основном связано с кавитация пузырьков газа, взаимодействующих с близлежащими клеточными мембранами, так как это усиливается добавлением ультразвукового контрастного вещества, источника ядер кавитации.
  • Оптическая трансфекция представляет собой метод, при котором крошечное (~ 1 мкм в диаметре) отверстие временно создается в плазматической мембране клетки с помощью высоко сфокусированного лазера. Этот метод был впервые описан в 1984 году Tsukakoshi et al., Которые использовали Nd: YAG с утроенной частотой для создания стабильной и временной трансфекции нормальных клеток почек крысы.[23] В этом методе обрабатывается одна клетка за раз, что делает его особенно полезным для анализа отдельных клеток.
  • Слияние протопластов - это метод, при котором трансформированные бактериальные клетки обрабатывают лизоцимом для удаления клеточной стенки. После этого используются слитые агенты (например, вирус Сендай, ПЭГ, электропорация) для слияния протопласта, несущего интересующий ген, с целевой клеткой-реципиентом. Основным недостатком этого метода является то, что бактериальные компоненты также неспецифично вводятся в клетку-мишень.
  • Прокол представляет собой метод введения ДНК, связанной с поверхностью нановолокна, которое вставляется в клетку. Этот подход также может быть реализован с помощью массивов нановолокон, которые вводятся в большое количество клеток и неповрежденной ткани.
  • Гидродинамическая доставка это метод, используемый на мышах и крысах, но в меньшей степени на более крупных животных, у которых ДНК чаще всего плазмиды (в том числе транспозоны ) может быть доставлен в печень с помощью гидродинамической инъекции, которая включает инфузию относительно большого объема крови менее чем за 10 секунд; почти вся ДНК экспрессируется в печени с помощью этой процедуры.[24][25][26]

Методы на основе частиц

  • Прямой подход к трансфекции - это генная пушка, где ДНК соединена с наночастица из инертный твердое тело (обычно золото), которое затем "стреляет" прямо в целевую ячейку ядро.[27]
  • Магнитофекция, или магнитная трансфекция, представляет собой метод трансфекции, который использует магнитную силу для доставки ДНК в клетки-мишени. Нуклеиновые кислоты сначала связаны с магнитными наночастицами. Затем приложение магнитной силы толкает комплексы частиц нуклеиновой кислоты по направлению к клеткам-мишеням и внутрь, откуда освобождается груз.[28]
  • Прокол осуществляется путем прокалывания клеток удлиненными наноструктурами и массивами таких наноструктур, как углеродные нановолокна или кремний нанопровода которые были функционализированы с плазмида ДНК.
  • Другой метод трансфекции, основанный на частицах, известен как бомбардировка частицами. Нуклеиновая кислота доставляется через мембрану с высокой скоростью, обычно через микрочастицы.[2]

Другие (и гибридные) методы

Другие методы трансфекции включают нуклеофекция, который оказался очень эффективным при трансфекции Клеточная линия THP-1, создавая жизнеспособную клеточную линию, которая могла дифференцироваться в зрелые макрофаги,[29] и тепловой удар.

Вирусные методы

ДНК также можно вводить в клетки, используя вирусы как носитель. В таких случаях методика называется трансдукция, и клетки называют трансдуцированными. Аденовирус векторы могут быть полезны для методов вирусной трансфекции, поскольку они могут переносить гены в самые разные клетки человека и имеют высокие скорости переноса.[2] Лентивирусные векторы также полезны из-за их способности трансдуктировать клетки, в настоящее время не подвергающиеся митозу.

Стабильная и временная трансфекция

Стабильная и временная трансфекция различаются по своему долгосрочному воздействию на клетку; стабильно трансфицированная клетка будет постоянно экспрессировать трансфицированную ДНК и передавать ее дочерние клетки, в то время как временно трансфицированная клетка будет экспрессировать трансфицированную ДНК в течение короткого промежутка времени и не передавать ее дочерним клеткам.

Для некоторых применений трансфекции достаточно, если трансфицированный генетический материал экспрессируется только временно. Поскольку ДНК, вводимая в процессе трансфекции, обычно не интегрируется в ядерный геном, чужеродная ДНК будет разбавлена ​​через митоз или деградировал.[30] Клеточные линии, экспрессирующие Вирус Эпштейна-Барра (EBV) ядерный антиген 1 (EBNA1) или большой Т-антиген SV40, позволяют эписомальную амплификацию плазмид, содержащих вирусные точки начала репликации EBV (293E) или SV40 (293T), что значительно снижает скорость разведения.[31]

Если желательно, чтобы трансфицированный ген действительно оставался в геноме клетки и ее дочерних клеток, должна происходить стабильная трансфекция. Для этого маркерный ген котрансфицируется, что дает клетке некоторое селективное преимущество, такое как устойчивость к определенным токсин. Некоторые (очень немногие) трансфицированные клетки случайно интегрируют чужеродный генетический материал в свой геном. Если затем токсин добавить в культуру клеток, только те несколько клеток, в геном которых интегрирован маркерный ген, смогут размножаться, в то время как другие клетки умрут. После применения этого селективного стресса (давления отбора) в течение некоторого времени остаются только клетки со стабильной трансфекцией, которые можно культивировать дальше.[32]

Обычными агентами для выбора стабильной трансфекции являются:

Трансфекция РНК

Основная статья: Трансфекция РНК

РНК также можно трансфицировать в клетки для временной экспрессии кодируемого ею белка или для изучения Распад РНК кинетика. Трансфекция РНК часто используется в первичных клетках, которые не делятся.

миРНК также могут быть трансфицированы для достижения сайленсинга РНК (т. е. потери РНК и белка из гена-мишени). Это стало основным приложением в исследованиях для достижения "сбить "интересующих белков (например, эндотелин-1[33]) с потенциальным применением в генной терапии. Ограничением подхода сайленсинга являются токсичность трансфекции для клеток и потенциальные «нецелевые» эффекты на экспрессию других генов / белков.

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Трансфекция в Национальной медицинской библиотеке США Рубрики медицинской тематики (MeSH)
  2. ^ а б c d «Трансфекция». Руководство по протоколам и приложениям. Промега.
  3. ^ Трансдукция, генетическая в Национальной медицинской библиотеке США Рубрики медицинской тематики (MeSH)
  4. ^ "Трансфекция " в Медицинский словарь Дорланда
  5. ^ Камимура К., Суда Т., Чжан Г., Лю Д. (октябрь 2011 г.). «Достижения в системах доставки генов». Фармацевтическая медицина. 25 (5): 293–306. Дои:10.1007 / bf03256872. ЧВК  3245684. PMID  22200988.
  6. ^ Сол Дж. М., член парламента Линнеса, Б. Д. Ратнер, С. М. Джачелли, С. Г. Пан (ноябрь 2007 г.). «Доставка невирусных носителей генов из сферических каркасов фибрина для устойчивой экспрессии трансгена». Биоматериалы. 28 (31): 4705–16. Дои:10.1016 / j.biomaterials.2007.07.026. PMID  17675152.
  7. ^ Menuel S, Fontanay S, Clarot I, Duval RE, Diez L, Marsura A (декабрь 2008 г.). «Синтез и способность к комплексообразованию нового бис- (гуанидиний) -тетракис- (бета-циклодекстрин) дендримерного тетрапода в качестве потенциальной системы доставки генов (ДНК и миРНК). Изучение клеточной трансфекции миРНК». Биоконъюгат Химия. 19 (12): 2357–62. Дои:10.1021 / bc800193p. PMID  19053312.
  8. ^ Фишер Д., фон Харпе А., Кунат К., Петерсен Н., Ли Ю., Киссель Т. (2002). «Сополимеры этиленимина и N- (2-гидроксиэтил) этиленимина как инструменты для изучения влияния структуры полимера на физико-химические и биологические свойства комплексов ДНК». Биоконъюгат Химия. 13 (5): 1124–33. Дои:10.1021 / bc025550w. PMID  12236795.
  9. ^ «Реагенты для трансфекции на основе наночастиц». Ресурсы по исследованиям в области биологии. Transfection.ws.
  10. ^ Грэхем Флорида, ван дер Эб Эй Джей (апрель 1973 г.). «Новая методика определения инфекционности ДНК аденовируса 5 человека». Вирусология. 52 (2): 456–67. Дои:10.1016/0042-6822(73)90341-3. PMID  4705382.
  11. ^ Bacchetti S, Graham FL (апрель 1977 г.). «Перенос гена тимидинкиназы в клетки человека с дефицитом тимидинкиназы с помощью очищенной вирусной ДНК простого герпеса». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 74 (4): 1590–4. Bibcode:1977ПНАС ... 74.1590Б. Дои:10.1073 / пнас.74.4.1590. ЧВК  430836. PMID  193108.
  12. ^ Криглер М (1991). Перенос и экспрессия: лабораторное руководство. В. Х. Фриман. С. 96–97. ISBN  978-0-7167-7004-6.
  13. ^ Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M, Northrop JP, Ringold GM, Danielsen M (ноябрь 1987 г.). «Липофекция: высокоэффективная липид-опосредованная процедура ДНК-трансфекции». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 84 (21): 7413–7. Bibcode:1987PNAS ... 84.7413F. Дои:10.1073 / pnas.84.21.7413. ЧВК  299306. PMID  2823261.
  14. ^ Фельгнер Дж. Х., Кумар Р., Шридхар С. Н., Уиллер С. Дж., Цай Ю. Дж., Бордер Р., Рэмси П., Мартин М., Фельгнер П. Л. (январь 1994 г.). «Улучшенная доставка генов и исследования механизмов с помощью новой серии составов катионных липидов». Журнал биологической химии. 269 (4): 2550–61. PMID  8300583.
  15. ^ Pipes BL, Vasanwala FH, Tsang TC, Zhang T, Luo P, Harris DT (январь 2005 г.). «Кратковременный тепловой шок увеличивает стабильную интеграцию липид-опосредованных трансфекций ДНК». Биотехнологии. 38 (1): 48–52. Дои:10.2144 / 05381bm05. PMID  15679084.
  16. ^ Якобсен Л. Б., Кальвин С. А., Колвин К. Э., Райт М. (июнь 2004 г.). «Реагент для трансфекции FuGENE 6: нежная сила». Методы. Трансфекция клеток млекопитающих. 33 (2): 104–12. Дои:10.1016 / j.ymeth.2003.11.002. PMID  15121164.
  17. ^ Хеллгрен И., Дрвота В., Пипер Р., Энокссон С., Бломберг П., Ислам КБ, Сильвен С. (август 2000 г.). «Высокоэффективный клеточно-опосредованный перенос генов с использованием невирусных векторов и FuGene6: исследования in vitro и in vivo». Клеточные и молекулярные науки о жизни. 57 (8–9): 1326–33. Дои:10.1007 / PL00000769. PMID  11028922. S2CID  27916034.
  18. ^ Лакшмипати У, Тьягараджан Б (2011). Первичные и стволовые клетки: технологии и приложения переноса генов (1-е изд.). Вили-Блэквелл. ISBN  978-0-470-61074-9.
  19. ^ Арнольд А.С., Ляпорт В., Дюмон С., Апперт-Коллин А., Эрбахер П., Купен Г., Леви Р., Пуиндрон П., Гис Дж. П. (февраль 2006 г.). «Сравнение реагентов для эффективной трансфекции первичных миобластов человека: FuGENE 6, Effectene и ExGen 500». Фундаментальная и клиническая фармакология. 20 (1): 81–9. Дои:10.1111 / j.1472-8206.2005.00344.x. PMID  16448398. S2CID  42585711.
  20. ^ Сапра, Рахит; Verma, Ram P .; Maurya, Govind P .; Дхаван, Самир; Бабу, Джиша; Харидас, В. (13.11.2019). «Конструктор пептидов и белковых дендримеров: поперечный анализ». Химические обзоры. 119 (21): 11391–11441. Дои:10.1021 / acs.chemrev.9b00153. ISSN  0009-2665. PMID  31556597.
  21. ^ Хайц, Марк; Явор, Саша; Дарбре, Тамис; Реймон, Жан-Луи (21.08.2019). «Стереоселективные pH-чувствительные пептидные дендримеры для трансфекции миРНК». Биоконъюгат Химия. 30 (8): 2165–2182. Дои:10.1021 / acs.bioconjchem.9b00403. ISSN  1043-1802. PMID  31398014.
  22. ^ Шареи А., Золдан Дж., Адамо А., Сим В.Й., Чо Н, Джексон Э, Мао С., Шнайдер С., Хан М.Дж., Литтон-Жан А., Басто П.А., Джунджхунвала С., Ли Дж., Хеллер Д.А., Кан Дж.В., Хартуларос Г.К., Ким К.С., Андерсон Д.Г., Лангер Р., Дженсен К.Ф. (февраль 2013 г.). «Безвекторная микрофлюидная платформа для внутриклеточной доставки». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 110 (6): 2082–7. Bibcode:2013ПНАС..110.2082С. Дои:10.1073 / pnas.1218705110. ЧВК  3568376. PMID  23341631.
  23. ^ Цукакоши М., Курата С., Номия Ю. и др. (1984). «Новый метод трансфекции ДНК с помощью хирургии клеток с использованием лазерного микропучка». Прикладная физика B: Фотофизика и лазерная химия. 35 (3): 135–140. Bibcode:1984АпФБ..35..135Т. Дои:10.1007 / BF00697702. S2CID  123250337.
  24. ^ Чжан Г., Будкер В., Вольф Дж. А. (июль 1999 г.). «Высокий уровень экспрессии чужеродных генов в гепатоцитах после инъекции в хвостовую вену обнаженной плазмидной ДНК». Генная терапия человека. 10 (10): 1735–7. Дои:10.1089/10430349950017734. PMID  10428218.
  25. ^ Чжан Дж., Варго Д., Будкер В., Армстронг Н., Кнехтл С., Вольф Дж. А. (октябрь 1997 г.). «Экспрессия обнаженной плазмидной ДНК, введенной в афферентные и эфферентные сосуды печени грызунов и собак». Генная терапия человека. 8 (15): 1763–72. Дои:10.1089 / hum.1997.8.15-1763. PMID  9358026.
  26. ^ Белл Дж. Б., Подец-Педерсен К. М., Аронович Е. Л., Белур Л. Р., Макайвор Р. С., Хакетт ПБ (2007). «Преимущественная доставка транспозонной системы« Спящая красавица »в печень мышей путем гидродинамической инъекции». Протоколы природы. 2 (12): 3153–65. Дои:10.1038 / nprot.2007.471. ЧВК  2548418. PMID  18079715.
  27. ^ О'Брайен, Джон А .; Ламмис, Сара CR (2011). «Нанобиолистика: метод биолистической трансфекции клеток и тканей с использованием генной пушки с новыми снарядами нанометрового размера». BMC Biotechnology. 11: 66. Дои:10.1186/1472-6750-11-66. ЧВК  3144454. PMID  21663596.
  28. ^ «Магнитофекция - трансфекция и трансдукция с помощью магнитных полей». OzBiosciences - искусство систем доставки.
  29. ^ Schnoor M, Buers I, Sietmann A, Brodde MF, Hofnagel O, Robenek H, Lorkowski S (май 2009 г.). «Эффективная невирусная трансфекция клеток THP-1». Журнал иммунологических методов. 344 (2): 109–15. Дои:10.1016 / j.jim.2009.03.014. PMID  19345690.
  30. ^ Ким Т.К., Эбервин Дж. Х. (август 2010 г.). «Трансфекция клеток млекопитающих: настоящее и будущее». Аналитическая и биоаналитическая химия. 397 (8): 3173–8. Дои:10.1007 / s00216-010-3821-6. ЧВК  2911531. PMID  20549496.
  31. ^ Дюроше Ю., Перре С., Камен А. (январь 2002 г.). «Высокоуровневое и высокопроизводительное производство рекомбинантного белка путем временной трансфекции суспензионных человеческих клеток 293-EBNA1». Исследования нуклеиновых кислот. 30 (2): 9e – 9. Дои:10.1093 / nar / 30.2.e9. ЧВК  99848. PMID  11788735.
  32. ^ Фанелли А (2016). «Наука создания стабильной клеточной линии». Получено 23 декабря 2017.
  33. ^ Mawji IA, Marsden PA (июнь 2006 г.). «Трансфекция РНК - универсальный инструмент для изучения посттранскрипционной регуляции эндотелина-1». Экспериментальная биология и медицина. 231 (6): 704–708. Дои:10.3181/00379727-231-2310704 (неактивно 11.11.2020). PMID  16740984.CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на ноябрь 2020 г. (ссылка на сайт)

дальнейшее чтение

внешние ссылки