Вектор (молекулярная биология) - Vector (molecular biology)

Для использования в других целях см. Вектор.

В молекулярное клонирование, а вектор представляет собой молекулу ДНК, используемую в качестве средства для искусственного переноса чужеродного генетического материала в другой клетка, где это может быть воспроизведен и / или выразил (например., плазмида, космид, Лямбда-фаги ). Вектор, содержащий чужеродную ДНК, называется рекомбинантная ДНК. Четыре основных типа векторов: плазмиды, вирусные векторы, космиды, и искусственные хромосомы. Из них наиболее часто используемыми векторами являются плазмиды.[1] Общие для всех сконструированных векторов имеют начало репликации, а сайт мультиклонирования, а выбираемый маркер.

Сам вектор обычно ДНК последовательность, состоящая из вставлять (трансген ) и более крупную последовательность, которая служит «костяком» вектора. Назначение вектора, который передает генетическую информацию в другую клетку, обычно состоит в том, чтобы изолировать, размножить или экспрессировать вставку в клетке-мишени. Все векторы могут быть использованы для клонирования и поэтому клонирование векторов, но есть также векторы, разработанные специально для клонирования, тогда как другие могут быть разработаны специально для других целей, таких как транскрипция и экспрессия белков. Векторы, разработанные специально для экспрессии трансгена в клетке-мишени, называются векторы экспрессии, и обычно промоутер последовательность, которая управляет экспрессией трансгена. Более простые векторы, называемые векторами транскрипции, способны только транскрибироваться, но не транслироваться: они могут реплицироваться в клетке-мишени, но не экспрессироваться, в отличие от векторов экспрессии. Векторы транскрипции используются для усиления их вставки.

Манипуляции с ДНК обычно проводятся на Кишечная палочка векторы, содержащие элементы, необходимые для их поддержания в Кишечная палочка. Однако векторы могут также иметь элементы, которые позволяют им сохраняться в другом организме, таком как клетки дрожжей, растений или млекопитающих, и эти векторы называются шаттл векторов. Такие векторы содержат бактериальные или вирусные элементы, которые могут переноситься в небактериальный организм-хозяин, однако другие векторы, называемые внутригенными векторами, также были разработаны, чтобы избежать переноса любого генетического материала от чужеродных видов.[2]

Вставка вектора в целевую ячейку обычно называется трансформация для бактериальных клеток,[3] трансфекция за эукариотические клетки,[4] хотя введение вирусного вектора часто называют трансдукция.[5]

Характеристики

Плазмиды

Основная статья: Плазмидный вектор

Плазмиды представляют собой двухцепочечные внехромосомные и обычно кольцевые последовательности ДНК, способные к репликации с использованием репликационного аппарата клетки-хозяина.[6] Плазмидные векторы минималистично состоят из начало репликации что делает возможным полунезависимую репликацию плазмиды в хозяине. Плазмиды широко обнаружены у многих бактерий, например у кишечная палочка, но также может быть обнаружен у некоторых эукариот, например у дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae.[7] Бактериальные плазмиды могут быть конъюгативными / трансмиссивными и неконъюгативными:

  • конъюгативные - опосредуют перенос ДНК посредством конъюгации и поэтому быстро распространяются среди бактериальных клеток популяции; например, плазмида F, многие плазмиды R и некоторые col.
  • неконъюгативный - не опосредует ДНК посредством конъюгации, например, многие плазмиды R и col.
В pBR322 плазмида - одна из первых плазмид, широко используемых в качестве клонирование вектор.

Плазмиды со специально сконструированными функциями обычно используются в лаборатории для цели клонирования. Эти плазмиды обычно не конъюгативны, но могут иметь гораздо больше функций, в частности "сайт множественного клонирования "где несколько рестрикционный фермент Сайты расщепления позволяют вставку трансгена. Бактерии, содержащие плазмиды, могут генерировать миллионы копий вектора внутри бактерий за часы, а амплифицированные векторы могут быть извлечены из бактерий для дальнейших манипуляций. Плазмиды можно использовать конкретно в качестве векторов транскрипции, и в таких плазмидах могут отсутствовать важные последовательности для экспрессии белка. Плазмиды, используемые для экспрессии белков, называемые векторы экспрессии, будет включать элементы для трансляции белка, такие как сайт связывания рибосомы, Начните и стоп-кодоны.

Вирусные векторы

Основная статья: Вирусный вектор

Вирусные векторы обычно представляют собой генно-инженерные вирусы, несущие модифицированную вирусную ДНК или РНК, которые были признаны неинфекционными, но все же содержат вирусные промоторы, а также трансген, что позволяет осуществлять трансляцию трансгена через вирусный промотор. Однако, поскольку вирусные векторы часто не имеют инфекционных последовательностей, им требуются вспомогательные вирусы или упаковочные линии для крупномасштабной трансфекции. Вирусные векторы часто предназначены для постоянного включения вставки в геном хозяина и, таким образом, оставляют отдельные генетические маркеры в геном хозяина после включения трансгена. Например, ретровирусы оставить характеристику ретровирусная интеграция образец после вставки, который поддается обнаружению и указывает на то, что вирусный вектор встроен в геном хозяина.

Искусственные хромосомы

Основная статья: Искусственная хромосома (значения)

Искусственные хромосомы - это искусственные хромосомы в контексте искусственные хромосомы дрожжей (YAC), бактериальные искусственные хромосомы (BACs) или искусственные хромосомы человека (ВАК). Искусственная хромосома может нести гораздо больший фрагмент ДНК, чем другие векторы.[8] YAC и BAC могут нести фрагмент ДНК длиной до 300 000 нуклеотидов. Три структурных необходимости искусственной хромосомы включают начало репликации, центромеру и концевые последовательности теломеров.[9]

Транскрипция

Транскрипция клонированного гена является необходимым компонентом вектора, когда требуется экспрессия гена: один ген может быть амплифицирован посредством транскрипции для создания нескольких копий мРНК, матрица, на которой белок может производиться посредством трансляции.[10] Большее количество мРНК будет экспрессировать большее количество белка, и количество генерируемых копий мРНК зависит от промотора, используемого в векторе.[11] Экспрессия может быть конститутивной, что означает, что белок постоянно продуцируется в фоновом режиме, или может быть индуцибельной, при этом белок экспрессируется только при определенных условиях, например, когда добавлен химический индуктор. Эти два разных типа экспрессии зависят от типов промотора и оператор использовал.

Вирусные промоторы часто используются для конститутивной экспрессии в плазмидах и вирусных векторах, поскольку они обычно надежно вызывают постоянную транскрипцию во многих клеточных линиях и типах.[12] Индуцируемая экспрессия зависит от промоторов, которые реагируют на условия индукции: например, вирус опухоли молочной железы мыши промотор инициирует транскрипцию только после дексаметазон приложение и Дрозофилия Промотор теплового шока активируется только после высоких температур.

Некоторые векторы предназначены только для транскрипции, например для in vitro производство мРНК. Эти векторы называются векторами транскрипции. В них могут отсутствовать последовательности, необходимые для полиаденилирования и терминации, поэтому их нельзя использовать для продукции белка.

Выражение

Основная статья: Вектор выражения

Векторы экспрессии продуцировать белки посредством транскрипции вставки вектора с последующим перевод из мРНК произведенные, они поэтому требуют больше компонентов, чем более простые векторы только для транскрипции. Для экспрессии в разных организмах-хозяевах потребуются разные элементы, хотя они имеют схожие требования, например промотор для инициации транскрипции, сайт связывания рибосом для сигналов начала трансляции и завершения.

Вектор экспрессии прокариот

Вектор экспрессии эукариот

Для векторов экспрессии эукариот требуются последовательности, которые кодируют:

  • Хвост полиаденилирования: Создает хвост полиаденилирования на конце транскрибируемой пре-мРНК, который защищает мРНК от экзонуклеазы и обеспечивает терминацию транскрипции и трансляции: стабилизирует продукцию мРНК.
  • Минимальный UTR длина: UTR содержат определенные характеристики, которые могут препятствовать транскрипции или трансляции, и, таким образом, самые короткие UTR или их отсутствие вообще кодируются в оптимальных векторах экспрессии.
  • Последовательность Козака: Векторы должны кодировать последовательность Козака в мРНК, которая собирает рибосома для трансляции мРНК.

Функции

Современные искусственно созданные векторы содержат важные компоненты, присутствующие во всех векторах, и могут содержать другие дополнительные функции, обнаруженные только в некоторых векторах:

  • Происхождение репликации: Необходим для репликации и поддержания вектора в клетке-хозяине.
  • Промоутер: Промоторы используются для управления транскрипцией трансгена вектора, а также других генов в векторе, таких как ген устойчивости к антибиотикам. Немного клонирование векторов не обязательно иметь промотор для клонированной вставки, но он является важным компонентом векторов экспрессии, так что клонированный продукт может быть экспрессирован.
  • Сайт клонирования: это может быть сайт множественного клонирования или другие функции, которые позволяют вставлять чужеродную ДНК в вектор через перевязка.
  • Генетические маркеры: Генетические маркеры для вирусных векторов позволяют подтвердить, что вектор интегрирован с геномной ДНК хозяина.
  • Антибиотик устойчивость: переносчики с устойчивостью к антибиотикам открытые рамки для чтения позволяют выжить клеткам, которые поглотили вектор в питательной среде, содержащей антибиотики, путем отбора антибиотиков.
  • Эпитоп: Некоторые векторы могут содержать последовательность для конкретного эпитопа, который может быть включен в экспрессируемый белок. Это позволяет идентифицировать антитела к клеткам, экспрессирующим целевой белок.
  • Репортерные гены: Некоторые векторы могут содержать репортерный ген, позволяющий идентифицировать плазмиду, содержащую встроенную последовательность ДНК. Примером является lacZ-α который кодирует N-концевой фрагмент β-галактозидаза, фермент, который переваривает галактоза. Сайт множественного клонирования находится внутри lacZ-α, а вставка, успешно лигированная в вектор, нарушит последовательность гена, что приведет к неактивной β-галактозидазе. Клетки, содержащие вектор со вставкой, можно идентифицировать с помощью синий / белый выбор путем выращивания клеток в средах, содержащих аналог галактозы (X-gal ). Клетки, экспрессирующие β-галактозидазу (поэтому не содержат вставки), выглядят как синие колонии. Белые колонии будут выбраны как те, которые могут содержать вставку. Другие часто используемые репортеры включают зеленый флуоресцентный белок и люцифераза.
  • Нацеливающая последовательность: векторы экспрессии могут включать кодирование нацеливающей последовательности в готовом белке, которая направляет экспрессируемый белок на конкретную органеллу в клетке или конкретное место, такое как периплазматическое пространство бактерий.
  • Теги очистки белка: Некоторые векторы экспрессии включают белки или пептидные последовательности, которые позволяют облегчить очистку экспрессируемого белка. Примеры включают полигистидин-тег, глутатион-S-трансфераза, и белок, связывающий мальтозу. Некоторые из этих тегов могут также способствовать повышению растворимости целевого белка. Целевой белок сливается с белковой меткой, но сайт расщепления протеазой, расположенный в области полипептидного линкера между белком и меткой, позволяет удалить метку позже.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Лодиш Х, Берк А, Зипурски С.Л., Мацудаира П., Балтимор Д., Дарнелл Дж. (2000). «Клонирование ДНК с плазмидными векторами». Молекулярная клеточная биология (4-е изд.). Нью-Йорк: У. Х. Фриман.
  2. ^ Acquaah G (16 августа 2012 г.). Принципы генетики и селекции растений. John Wiley & Sons Inc. ISBN  978-1-118-31369-5.
  3. ^ Джонстон К., Мартин Б., Фичант Дж., Полард П., Клаверис Дж. П. (март 2014 г.). «Бактериальная трансформация: распространение, общие механизмы и дивергентный контроль». Обзоры природы. Микробиология. 12 (3): 181–96. Дои:10.1038 / nrmicro3199. PMID  24509783. S2CID  23559881.
  4. ^ "MeSH Browser". meshb.nlm.nih.gov. Получено 2018-04-16.
  5. ^ Хартл Д.Л., Джонс Е.В. (1998). Генетика: принципы и анализ (4-е изд.). Садбери, Массачусетс: издательство «Джонс и Бартлетт». ISBN  978-0-7637-0489-6. OCLC  45730915.
  6. ^ дель Солар, Глория; Хиральдо, Рафаэль; Руис-Эчеваррия, Мария Хесус; Эспиноза, Мануэль; Диас-Орехас, Рамон (июнь 1998 г.). «Репликация и контроль циркулярных бактериальных плазмид». Обзоры микробиологии и молекулярной биологии. 62 (2): 434–464. Дои:10.1128 / MMBR.62.2.434-464.1998. ISSN  1092-2172. ЧВК  98921. PMID  9618448.
  7. ^ Браун Т.А. (2010). «Глава 2 - Векторы для клонирования генов: плазмиды и бактериофаги». Клонирование генов и анализ ДНК: введение (6-е изд.). Вили-Блэквелл. ISBN  978-1-4051-8173-0.
  8. ^ Джулин, Дуглас (2014). «Искусственные хромосомы». Молекулярные науки о жизни. Спрингер, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. С. 1–3. Дои:10.1007/978-1-4614-6436-5_91-3. ISBN  978-1-4614-6436-5.
  9. ^ Мюррей, Эндрю; Шостак, Джек (ноябрь 1987 г.). «Искусственные хромосомы». Scientific American. 257 (5): 62–68. Bibcode:1987SciAm.257e..62M. Дои:10.1038 / scientificamerican1187-62. PMID  3317814.
  10. ^ Соломон Е.П., Берг Л.Р., Мартин Д.В. (2005). Биология (8-е изд.). Бельмонт, Калифорния: Брукс / Коул Томсон Обучение. ISBN  978-0-495-31714-2. OCLC  123008833.
  11. ^ Дамдиндорж Л., Карнан С., Ота А., Хосейн Е., Кониси И., Хосокава И., Кониси Х. (2014-08-29). «Сравнительный анализ конститутивных промоторов, расположенных в аденоассоциированных вирусных векторах». PLOS ONE. 9 (8): e106472. Bibcode:2014PLoSO ... 9j6472D. Дои:10.1371 / journal.pone.0106472. ЧВК  4149579. PMID  25170953.
  12. ^ Левин А., Майер М., Чусаинов Дж., Джейкоб Д., Аппель Б. (июнь 2005 г.). «Вирусные промоторы могут инициировать экспрессию генов токсинов, введенных в Escherichia coli». BMC Biotechnology. 5: 19. Дои:10.1186/1472-6750-5-19. ЧВК  1181807. PMID  15967027.

дальнейшее чтение

  • Freshney IR (29 июля 2005 г.). Культура клеток животных: руководство по базовой методике. Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons, Inc. ISBN  978-0-471-45329-1.

внешняя ссылка