Космид - Cosmid

А космид это тип гибрида плазмида который содержит Лямбда-фаг потому что последовательность. Космиды (потому что сайтов + плазмида = космиды) последовательности ДНК происходят из лямбда-фаг.[1] Их часто используют как клонирование вектор в генная инженерия. Космиды можно использовать для строительства геномные библиотеки. Впервые они были описаны Коллинзом и Хоном в 1978 году.[2]Космиды могут содержать от 37 до 52 (обычно 45) kb ДНК, пределы основаны на нормальном размере упаковки бактериофага. Они могут копировать как плазмиды, если у них есть подходящие начало репликации (ori): например SV40 ori в клетках млекопитающих, ColE1 ori для репликации двухцепочечной ДНК, или f1 ori для репликации одноцепочечной ДНК в прокариоты. Часто они также содержат ген отбора, такой как устойчивость к антибиотикам, так что трансформированные клетки могут быть идентифицированы путем посева на среду, содержащую антибиотик. Те клетки, которые не захватили космиду, не смогли бы расти.[3]

В отличие от плазмид, они также могут быть упакованы in vitro в фаг капсиды, шаг, который требует связные концы, также известный как потому что сайты также использовались при клонировании с фагом лямбда в качестве вектора, однако почти все гены лямбда были удалены, за исключением потому что последовательность. Гибридная космидная ДНК в капсидах может быть перенесена в бактериальные клетки посредством трансдукция. Поскольку существует потребность в упаковке in vitro, при которой требуется по крайней мере 38 т.п.н. ДНК между сайтами cos, вектор без ДНК вставки не будет упакован (нестабильность плазмид увеличивается, если новая вставленная ДНК содержит много прямых повторов или палиндромных (инвертированных) повторов) ДНК. Этой нестабильности можно в значительной степени противодействовать, используя бактерию-хозяин со специфическими мутациями, влияющими на рекомбинацию ДНК (NB. Отсутствие инвертированных повторов было отмечено в первой публикации Hohn & Collins, процитированной выше; см. также[4]).

Cos последовательности

Cos последовательности имеют длину ~ 200 пар оснований и необходимы для упаковки. Они содержат cosN сайт, где ДНК разрывается на каждой цепи, на расстоянии 12 п.н., прекращение. Это вызывает линеаризацию кругового космида с двумя «связными» или «липкими концами» по 12 п.н. (ДНК должна быть линейной, чтобы соответствовать фаговой головке.) cosB сайт удерживает терминал, пока он перебирает и разделяет нити. В cosQ местонахождение следующего космида (как репликация катящегося круга часто приводит к линейному конкатемеры ) удерживается терминазой после того, как предыдущая космида была упакована, чтобы предотвратить разрушение клетками. ДНКазы.

Особенности и использование Cosmid

Схема клонирования ДНК в космидном векторе.

Космиды - это преимущественно плазмиды с бактериальным oriV, маркер селекции антибиотика и сайт клонирования, но они несут один или недавно два сайта cos, происходящие от лямбда бактериофага. В зависимости от конкретной цели эксперимента доступны космиды широкого круга хозяев, космиды челноков или космиды «млекопитающих» (связанные с SV40 oriV и маркерами селекции млекопитающих). Грузоподъемность космид варьируется в зависимости от размера самого вектора, но обычно составляет около 40–45 кб. Процедура клонирования включает создание двух векторных ветвей, которые затем присоединяются к чужеродной ДНК. Отбор против космидной ДНК дикого типа просто осуществляется путем исключения размера. Следовательно, космиды всегда образуют колонии, а не бляшки. Также плотность клонов намного ниже - около 105 – 106 КОЕ на мкг лигированной ДНК.

После создания библиотек рекомбинантных лямбда или космид общую ДНК переносят в соответствующий Кишечная палочка с помощью метода, называемого упаковкой in vitro. Необходимые упаковочные экстракты получены из Кишечная палочка лизогены cI857 (red-gam-Sam и Dam (головной узел) и Eam (хвостовой узел) соответственно). Эти экстракты распознают и упаковывают рекомбинантные молекулы. in vitro, генерируя либо зрелые фаговые частицы (векторы на основе лямбда), либо рекомбинантные плазмиды, содержащиеся в оболочках фага (космиды). Эти различия отражаются в различной частоте инфицирования, наблюдаемой в пользу векторов с заменой лямбда. Это компенсирует их немного меньшую грузоподъемность. Библиотеки фагов также легче хранить и проверять, чем библиотеки космид.

Целевая ДНК: клонируемая геномная ДНК должна быть разрезана на рестрикционные фрагменты соответствующего размера. Обычно это делается путем частичного ограничения с последующим либо фракционированием по размеру, либо дефосфорилированием (с использованием фосфатазы из кишечника теленка), чтобы избежать скремблирования хромосом, то есть лигирования физически несвязанных фрагментов.

Примеры космидных векторов

Обычно используемые векторы включают "SuperCos 1"

Рекомендации

  1. ^ Хон Б., Мюррей К. (август 1977 г.). «Упаковка рекомбинантных молекул ДНК в частицы бактериофага in vitro». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 74 (8): 3259–63. Bibcode:1977PNAS ... 74.3259H. Дои:10.1073 / пнас.74.8.3259. ЧВК  431522. PMID  333431.
  2. ^ Коллинз Дж., Хон Б. (сентябрь 1978 г.). «Космиды: тип вектора клонирования плазмидного гена, который упаковывается in vitro в лямбда-головки бактериофага». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 75 (9): 4242–6. Bibcode:1978PNAS ... 75.4242C. Дои:10.1073 / пнас.75.9.4242. ЧВК  336088. PMID  360212.
  3. ^ "Космиды". Филип МакКлин. Получено 4 апреля, 2014.
  4. ^ Коллинз Дж. (1981). «Нестабильность палиндромной ДНК в Escherichia coli». Симпозиумы Колд-Спринг-Харбор по количественной биологии. 45 Пет 1: 409–16. Дои:10.1101 / SQB.1981.045.01.055. PMID  6271486.

дальнейшее чтение