Трансфекция РНК - Википедия - RNA transfection

Смотрите также: РНК-вакцина и Трансфекция

Трансфекция РНК это процесс преднамеренного введения РНК в жизнь клетка. РНК можно очистить от клеток после лизис или синтезированы из свободных нуклеотиды химически или ферментативно с использованием РНК-полимераза к расшифровывать а ДНК шаблон. Как и в случае с ДНК, РНК может быть доставлена ​​в клетки различными способами, включая микроинъекция, электропорация, и липид-опосредованная трансфекция. Если РНК кодирует белок, трансфицированные клетки могут переведите РНК в кодируемый белок. Если РНК является регуляторной РНК (например, miRNA ), РНК может вызывать другие изменения в клетке (например, РНКи-опосредованный нокдаун ).

Инкапсуляция молекулы РНК в липидные наночастицы был прорывом в производстве жизнеспособных РНК-вакцины, решая ряд ключевых технических препятствий на пути доставки молекулы РНК в клетку человека.[1]

Терминология

Молекулы РНК короче примерно 25 нм в значительной степени ускользают от обнаружения врожденная иммунная система, который запускается более длинными молекулами РНК. Большинство клеток организма экспрессируют белки врожденной иммунной системы, и при воздействии экзогенных длинных молекул РНК эти белки инициируют сигнальные каскады, которые приводят к воспаление. Это воспаление повышает чувствительность пораженной клетки и близлежащих клеток к последующему воздействию. В результате, хотя клетка может быть повторно трансфицирована короткой РНК с небольшими неспецифическими эффектами, повторная трансфекция клеток даже небольшим количеством длинной РНК может вызвать гибель клетки, если не будут приняты меры для подавления или уклонения от врожденной иммунной системы (см. «Трансфекция длинной РНК» ниже).

Трансфекция короткой РНК

Трансфекция короткой РНК обычно используется в биологических исследованиях для подавления экспрессии представляющего интерес белка (с использованием миРНК ) или чтобы выразить или заблокировать деятельность miRNA (с использованием короткой РНК, которая действует независимо от клеточного РНКи механизм, и поэтому не упоминается как siRNA). В то время как векторы на основе ДНК (вирусы, плазмиды ), которые кодируют короткую молекулу РНК, также можно использовать, трансфекция короткой РНК не подвергает риску модификацию ДНК клетки, что привело к развитию короткой РНК как нового класса макромолекулярный наркотики.[2]

Трансфекция длинной РНК

Трансфекция длинной РНК - это процесс преднамеренного введения молекул РНК длиной более 25 нт в живые клетки. Различают трансфекцию короткой и длинной РНК, поскольку экзогенные длинные молекулы РНК вызывают врожденный иммунный ответ в клетках, которые могут вызывать различные неспецифические эффекты, включая перевод блокировать, клеточный цикл арестовать и апоптоз.

Эндогенная и экзогенная длинная РНК

Врожденная иммунная система эволюционировала для защиты от инфекционное заболевание путем обнаружения патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs) и запускает сложный набор ответов, известных под общим названием «воспаление ». Многие клетки экспрессируют специфические рецепторы распознавания образов (PRR) для экзогенной РНК, включая толл-подобный рецептор 3,7,8 (TLR3, TLR7, TLR8 ),[3][4][5][6] РНК геликаза RIG1 (RARRES3),[7] протеинкиназа R (PKR, он же EIF2AK2),[8][9] члены семейства белков олигоаденилатсинтетазы (OAS1, OAS2, OAS3 ), и другие. Все эти белки могут специфически связываться с экзогенными молекулами РНК и запускать иммунный ответ. Специфические химические, структурные или другие характеристики длинных молекул РНК, которые необходимы для распознавания PRR, остаются в значительной степени неизвестными, несмотря на интенсивные исследования. В любой момент времени типичный млекопитающее клетка может содержать несколько сотен тысяч мРНК и другие, регуляторная длинная РНК молекулы. Как клетки отличают экзогенную длинную РНК от большого количества эндогенной длинной РНК, является важным открытым вопросом в клеточная биология. Несколько отчетов предполагают, что фосфорилирование 5'-конца длинной молекулы РНК может влиять на ее иммуногенность и, в частности, 5'-трифосфатная РНК, которая может продуцироваться во время вирусной инфекции, является более иммуногенной, чем 5'-дифосфатная РНК, 5'-монофосфатная РНК или РНК, не содержащая 5'-фосфата.[10][11][12][13][14][15] Однако длинная РНК, транскрибируемая in vitro (ivT), содержащая 7-метилгуанозиновый кэп (присутствует в эукариотический мРНК) также обладает высокой иммуногенностью, несмотря на отсутствие 5'-фосфата,[16] предполагая, что характеристики, отличные от 5'-фосфорилирования, могут влиять на иммуногенность молекулы РНК.

МРНК эукариот содержит химически модифицированные нуклеотиды, такие как N6-метиладенозин, 5-метилцитидин, и 2'-O-метилированный нуклеотиды. Хотя только очень небольшое количество этих модифицированных нуклеотидов присутствует в типичной молекуле мРНК, они могут помочь предотвратить активацию мРНК врожденной иммунной системы, нарушая вторичная структура что напоминало бы двухцепочечную РНК (дцРНК),[5] тип РНК, которая, как считается, присутствует в клетках только во время вирусной инфекции. Иммуногенность длинной РНК была использована для изучения как врожденных, так и адаптивный иммунитет.

Повторная трансфекция длинной РНК

Подавляя только три белка, интерферон-β, STAT2, и EIF2AK2 достаточно, чтобы спасти человека фибробласты от гибели клеток, вызванной частой трансфекцией длинной, кодирующей белок РНК.[16] Ингибирование передачи сигналов интерферона нарушает петлю положительной обратной связи, которая обычно вызывает гиперчувствительность клеток, подвергшихся воздействию экзогенной длинной РНК. Недавно исследователи использовали этот метод, чтобы выразить перепрограммирование белков в первичном человеке фибробласты.[17]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Куни, Элизабет (1 декабря 2020 г.). «Как нанотехнологии помогают мРНК вакцины Covid-19 работать». Стат. Получено 3 декабря 2020.
  2. ^ Тэнси Б. (11 августа 2006 г.). «Лечение дегенерации желтого пятна препятствует передаче сообщений РНК». Хроники Сан-Франциско.
  3. ^ Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA (2001). «Распознавание двухцепочечной РНК и активация NF-kappaB Toll-подобным рецептором 3». Природа. 413 (6857): 732–738. Дои:10.1038/35099560. PMID  11607032. S2CID  4346537.
  4. ^ Карико К., Ни Х, Каподичи Дж, Ламфье М., Вайсман Д. (2004). «мРНК является эндогенным лигандом для Toll-подобного рецептора 3». J Biol Chem. 279 (13): 12542–12550. Дои:10.1074 / jbc.M310175200. PMID  14729660.
  5. ^ а б Карико К., Бакштейн М., Ни Х, Вайсман Д. (2005). «Подавление распознавания РНК Toll-подобными рецепторами: влияние модификации нуклеозидов и эволюционное происхождение РНК». Иммунитет. 23 (2): 165–175. Дои:10.1016 / j.immuni.2005.06.008. PMID  16111635.
  6. ^ Diebold SS, Kaisho T, Hemmi H, Akira S, Reis e Sousa C. (2004). «Врожденные противовирусные ответы посредством TLR7-опосредованного распознавания одноцепочечной РНК». Наука. 303 (5663): 1529–1531. Дои:10.1126 / science.1093616. PMID  14976261. S2CID  33144196.
  7. ^ Ёнеяма М., Кикучи М., Нацукава Т., Синобу Н., Имаидзуми Т. и др. (2004). «РНК-геликаза RIG-I играет важную роль в врожденных противовирусных реакциях, индуцированных двухцепочечной РНК». Нат Иммунол. 5 (7): 730–737. Дои:10.1038 / ni1087. PMID  15208624. S2CID  34876422.
  8. ^ Das HK, Das A, Ghosh-Dastidar P, Ralston RO, Yaghmai B, et al. (1981). «Синтез белка в ретикулоцитах кролика. Очистка и характеристика двухцепочечного РНК-зависимого ингибитора синтеза белка из лизатов ретикулоцитов». J Biol Chem. 256 (12): 6491–6495. PMID  7240221.
  9. ^ Левин Д.Х., Петришин Р., Лондон IM (1981). «Характеристика очищенной двухцепочечной РНК-активированной eIF-2 альфа-киназы из ретикулоцитов кролика». J Biol Chem. 256 (14): 7638–7641. PMID  6265457.
  10. ^ Хорнунг В., Эллегаст Дж, Ким С., Брзозка К., Юнг А. и др. (2006). «5'-трифосфатная РНК является лигандом для RIG-I». Наука. 314 (5801): 994–997. Дои:10.1126 / наука.1132505. PMID  17038590. S2CID  22436759.
  11. ^ Сайто Т; Оуэн DM; Цзян Ф; Маркотриджиано Дж; Гейл М-младший (2008). «Врожденный иммунитет, индуцированный зависимым от состава RIG-I распознаванием РНК вируса гепатита С». Природа. 454 (7203): 523–527. Дои:10.1038 / природа07106. ЧВК  2856441. PMID  18548002.
  12. ^ Такахаси К., Йонеяма М., Нишихори Т., Хираи Р., Кумета Х. и др. (2008). «Механизм восприятия несамостоятельной РНК геликазы RIG-I и активация противовирусных иммунных ответов». Mol Cell. 29 (4): 428–440. Дои:10.1016 / j.molcel.2007.11.028. PMID  18242112.
  13. ^ Йонеяма М, Фудзита Т (2008). «Структурный механизм распознавания РНК RIG-I-подобными рецепторами». Иммунитет. 29 (2): 178–181. Дои:10.1016 / j.immuni.2008.07.009. PMID  18701081.
  14. ^ Schmidt A, Schwerd T., Hamm W., Hellmuth JC, Cui S, et al. (2009). «5'-трифосфатная РНК требует структур со спаренными основаниями для активации передачи противовирусных сигналов через RIG-I». Proc Natl Acad Sci USA. 106 (29): 12067–12072. Дои:10.1073 / pnas.0900971106. ЧВК  2705279. PMID  19574455.
  15. ^ Schlee M., Roth A, Hornung V, Hagmann CA, Wimmenauer V и др. (2009). «Для распознавания 5'-трифосфата с помощью геликазы RIG-I требуется короткая тупая двухцепочечная РНК, содержащаяся в панхолде вируса с отрицательной цепью». Иммунитет. 31 (1): 25–34. Дои:10.1016 / j.immuni.2009.05.008. ЧВК  2824854. PMID  19576794.
  16. ^ а б Ангел М, Яник М.Ф. (2010). «Подавление врожденного иммунитета делает возможной частую трансфекцию с помощью кодирующих репрограммирующих белков РНК». PLOS ONE. 5 (7): e11756. Дои:10.1371 / journal.pone.0011756. ЧВК  2909252. PMID  20668695.
  17. ^ Trafton A (26 июля 2010 г.). «РНК предлагает более безопасный способ перепрограммировать клетки». MIT News Office.

внешняя ссылка