Генная пушка - Gene gun

Система доставки частиц PDS-1000 / He

В генная инженерия, а генная пушка или же система доставки биологических частиц это устройство, используемое для доставки экзогенного ДНК (трансгены ), РНК, или же белок в клетки. Покрывая частицы тяжелый металл с помощью интересующего гена и запуска этих микрочастиц в клетки с использованием механической силы можно вызвать интеграцию желаемой генетической информации в клетки. Техника, связанная с такой доставкой ДНК микрочастицами, часто упоминается как биолистика.[1]

Это устройство способно трансформировать практически любой тип клетки и не ограничивается трансформацией ядра; он также может трансформировать органеллы, в том числе пластиды и митохондрии.[2]

Генная пушка используется для доставки экзогенной ДНК в клетки. Этот метод известен как «биолистика». Генные пушки можно эффективно использовать на большинстве клеток, но в основном они применяются на клетках растений. Шаг 1 Аппарат генной пушки готов к стрельбе. Шаг 2 Гелий заполняет камеру, и давление на разрывную мембрану увеличивается. Шаг 3 Давление в конечном итоге достигает точки, в которой разрывной диск разрывается, и возникающий в результате выброс гелия толкает макроноситель, покрытый ДНК / золотом («Пластиковый диск»), в стопорный экран. Шаг 4 Когда макроноситель попадает в стопорный экран, покрытые ДНК частицы золота продвигаются через экран в клетки-мишени.

Конструкция генного пистолета

Генная пушка изначально была Crosman пневматический пистолет модифицирован для плотного огня вольфрам частицы. Это было изобретено Джон С. Сэнфорд, Эд Вольф и Нельсон Аллен в Корнелл Университет[3][4][5] вместе с Тедом Кляйном из DuPont между 1983 и 1986 гг. Первоначальной целью был лук (выбранный из-за их большого размера ячеек), и устройство использовалось для доставки частиц, покрытых маркерный ген который будет передавать сигнал, если произойдет правильная вставка транскрипта ДНК.[6] Генетическая трансформация была продемонстрирована при наблюдаемой экспрессии маркерного гена в луковых клетках.

Самые ранние генные пушки, изготовленные на заказ (изготовленные Нельсоном Алленом), использовали калибр 22 строительный пистолет патрон для приведения в движение полиэтилен цилиндр (пуля) на ствол Дугласа 22 калибра. Капля вольфрамового порошка, покрытая генетическим материалом, помещалась на пулю и сбивалась в пулю. чашка Петри ниже. Пуля приварилась к диску под чашкой Петри, и генетический материал попал в образец с эффектом пончика, включающим разрушение в середине образца с кольцом хорошей трансформации по периферии. Пушка была подключена к вакуумному насосу и во время стрельбы находилась под вакуумом. Ранний дизайн был запущен в ограниченное производство на Rumsey-Loomis (местный механический цех тогда на Мекленбург-роуд в Итаке, штат Нью-Йорк, США).

Biolistics, Inc продала Dupont права на производство и распространение обновленного устройства с улучшениями, включая использование гелий в качестве невзрывоопасного пороха и многодискового ударного механизма для минимизации повреждения тканей образца. Другие тяжелые металлы, такие как золото и серебро также используются для доставки генетического материала, причем предпочтение отдается золоту из-за более низкой цитотоксичности по сравнению с вольфрамовыми носителями снарядов.[7]

Биолистическая конструкция конструкции

Биолистическая трансформация включает интеграцию функционального фрагмента ДНК, известного как конструкция ДНК, в клетки-мишени. Генная конструкция представляет собой кассету ДНК, содержащую все необходимые регуляторные элементы для правильной экспрессии в организме-мишени.[8][страница нужна ] Хотя генные конструкции могут различаться по своей конструкции в зависимости от желаемого результата процедуры трансформации, все конструкции обычно содержат комбинацию промоутер последовательность, a терминатор последовательность, интересующий ген и репортерный ген.

Промоутер:

Промоторы контролируют расположение и величину экспрессии гена и действуют как «рулевое колесо и педаль газа» для гена.[8][страница нужна ] Промоторы предшествуют интересующему гену в конструкции ДНК и могут быть изменены в лабораторных условиях для точной настройки экспрессии трансгена. Промоутер 35S от Вирус мозаики цветной капусты является примером обычно используемого промотора, который приводит к устойчивой конститутивной экспрессии генов в растениях.[9]

Терминатор:

Последовательности терминатора необходимы для правильной экспрессии гена и размещаются после кодирующей области интересующего гена в конструкции ДНК. Общий терминатор для биолистической трансформации - терминатор NOS, полученный из Agrobacterium tumefaciens. Из-за высокой частоты использования этого терминатора в генетически модифицированных растениях были разработаны стратегии для обнаружения его присутствия в продуктах питания для отслеживания несанкционированных генетически модифицированных культур.[10]

Репортерный ген:

Ген, кодирующий селективный маркер, является обычным элементом в конструкциях ДНК и используется для отбора правильно трансформированных клеток. Выбранный селектируемый маркер будет зависеть от трансформируемого вида, но, как правило, это будет ген, дающий клеткам способность к детоксикации определенных гербицидов или антибиотиков, таких как канамицин, гигромицин B, или же глифосат[8][страница нужна ].[11][12][13]

Дополнительные элементы:

Необязательные компоненты конструкции ДНК включают такие элементы, как Cre-lox последовательности, которые позволяют контролировать удаление конструкции из целевого генома.[14] Такие элементы выбираются разработчиком конструкции для выполнения специализированных функций наряду с основным представляющим интерес геном.

Заявление

Генные пушки в основном используются с растительными клетками. Тем не менее, его можно использовать и для людей, и для других животных.

Растения

Целью генной пушки часто является мозоль недифференцированных растительных клеток или группы незрелых зародышей, растущих на гелевой среде в чашке Петри. После того, как покрытые ДНК золотые частицы были доставлены в клетки, ДНК используется в качестве матрицы для транскрипции (временная экспрессия), а иногда она интегрируется в растение. хромосома («стабильное» преобразование)

Если доставленная конструкция ДНК содержит селектируемый маркер, то можно отобрать и культивировать стабильно трансформированные клетки с использованием методов культивирования тканей. Например, если доставленная конструкция ДНК содержит ген, который придает устойчивость к антибиотику или гербициду, то можно выбрать стабильно трансформированные клетки путем включения этого антибиотика или гербицида в среду для тканевой культуры.

Трансформированные клетки можно обработать рядом растительных гормонов, таких как ауксины и гиббереллины, и каждый может делиться и дифференцироваться в организованные специализированные тканевые клетки всего растения. Эта возможность полной регенерации называется тотипотентность. Новое растение, возникшее из успешно трансформированной клетки, может иметь новые наследственные черты. Использование генной пушки можно противопоставить использованию Agrobacterium tumefaciens и это Плазмида Ti для вставки ДНК в клетки растений. Видеть трансформация для разных методов трансформации у разных видов.

Люди и другие животные

Генные пушки также использовались для доставки ДНК-вакцины.

Доставка плазмид в нейроны крысы с помощью генной пушки, в частности нейронов DRG, также используется в качестве фармакологического предшественника при изучении эффектов нейродегенеративных заболеваний, таких как Болезнь Альцгеймера.

Генная пушка стала обычным инструментом для маркировки подмножеств клеток в культивируемых тканях. Помимо возможности трансфицировать клетки ДНК-плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки, генная пушка может быть адаптирована для доставки в клетки широкого спектра жизненно важных красителей.[15]

Бомбардировка генной пушкой также использовалась для преобразовать Caenorhabditis elegans, как альтернатива микроинъекция.[16]

Преимущества

Биолистика зарекомендовала себя как универсальный метод генетической модификации, и обычно предпочитают создавать устойчивые к трансформации культуры, такие как хлопья. В частности, Bt кукуруза продукт биолистики.[8][страница нужна ] Трансформация пластидов также добилась большого успеха при бомбардировке частицами по сравнению с другими современными методами, такими как Агробактерии опосредованная трансформация, которая затрудняет нацеливание вектора и стабильную экспрессию в хлоропласте.[8][страница нужна ][17] Кроме того, нет сообщений о хлоропласте. заглушить трансген вставлен с помощью генной пушки.[18] Кроме того, всего за один выстрел из генной пушки квалифицированный техник может создать два трансформированных организма.[17] Эта технология позволила даже модифицировать определенные ткани. на месте, хотя это может повредить большое количество клеток и преобразовать только некоторые, а не все клетки ткани.[19]

Ограничения

Биолистика случайным образом вводит ДНК в клетки-мишени. Таким образом, ДНК может быть трансформирована в любые геномы, присутствующие в клетке, будь то ядерные, митохондриальные, плазмидные или любые другие, в любой комбинации, хотя правильная конструкция конструкции может смягчить это. Доставка и интеграция нескольких матриц конструкции ДНК - отличная возможность, приводящая к потенциально переменным уровням экспрессии и количеству копий встроенного гена.[8][страница нужна ] Это происходит из-за способности конструкций отдавать и брать генетический материал от других конструкций, в результате чего одни не несут трансген, а другие несут множественные копии; количество вставленных копий зависит как от того, сколько копий трансгена имеет вставленная конструкция, так и от того, сколько было вставлено.[8][страница нужна ] Кроме того, поскольку эукариотические конструкции полагаются на незаконная рекомбинация - процесс, посредством которого трансген интегрируется в геном без аналогичных генетических последовательностей, а не гомологичная рекомбинация, они не могут быть нацелены на определенные участки генома,[8][страница нужна ] если трансген не доставляется совместно с редактирование генома реагенты.

Рекомендации

  1. ^ О'Брайен, Джон А .; Ламмис, Сара CR (2011). «Нанобиолистика: метод биолистической трансфекции клеток и тканей с использованием генной пушки с новыми снарядами нанометрового размера». BMC Biotechnology. 11: 66. Дои:10.1186/1472-6750-11-66. ЧВК  3144454. PMID  21663596.
  2. ^ Сэнфорд, Джон С. (1990). «Биолистическая трансформация растений». Physiologia Plantarum. 79 (1): 206–209. Дои:10.1111 / j.1399-3054.1990.tb05888.x. ISSN  1399-3054.
  3. ^ Сегелькен, Роджер (14 мая 1987 г.). «Биолог изобрел пистолет для стрельбы по клеткам ДНК» (PDF). Корнельская хроника. п. 3. Архивировано из оригинал (PDF) 29 октября 2013 г.. Получено 5 июн 2014.
  4. ^ Sanford, J.C .; Klein, T.M .; Wolf, E.D .; Аллен, Н. (1987). «Доставка веществ в клетки и ткани с использованием процесса бомбардировки частицами». Наука и технологии частиц. 5 (1): 27–37. Дои:10.1080/02726358708904533.
  5. ^ Klein, T.M .; Wolf, E.D .; Wu, R .; Сэнфорд, Дж. К. (май 1987 г.). «Высокоскоростные микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки». Природа. 327 (6117): 70–73. Bibcode:1987Натура.327 ... 70K. Дои:10.1038 / 327070a0. S2CID  4265777.
  6. ^ Сегелкен, Роджер. "Генный дробовик". Колледж сельского хозяйства и наук о жизни Корнельского университета. Архивировано из оригинал 26 апреля 2010 г.. Получено 5 июн 2014.
  7. ^ Рассел, Джули А .; Рой, Михир К .; Сэнфорд, Джон К. (1992-03-01). «Физическая травма и отравление вольфрамом снижают эффективность биологической трансформации». Физиология растений. 98 (3): 1050–1056. Дои:10.1104 / стр.98.3.1050. ISSN  0032-0889. ЧВК  1080307. PMID  16668726.
  8. ^ а б c d е ж грамм час Слейтер, Адриан; Скотт, Найджел; Фаулер, Марк (2008). Биотехнология растений: генетические манипуляции с растениями (2-е изд.). Оксфорд, Нью-Йорк, США: Oxford University Press Inc. ISBN  978-0-19-928261-6.
  9. ^ Benfey, P.N .; Чуа, Н.-Х. (1990-11-16). «Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты: комбинаторная регуляция транскрипции в растениях». Наука. 250 (4983): 959–966. Bibcode:1990Sci ... 250..959B. Дои:10.1126 / science.250.4983.959. ISSN  0036-8075. PMID  17746920. S2CID  35471862.
  10. ^ "терминатор нопалин-синтазы: темы сайта Science.gov". www.science.gov. Получено 2019-11-20.
  11. ^ Norris, M. H .; Kang, Y .; Лу, Д .; Wilcox, B.A .; Хоанг, Т. Т. (31 июля 2009 г.). «Устойчивость к глифосату как новый селективный агент-совместимый, не выбираемый антибиотиками маркер в хромосомном мутагенезе основных генов asd и dapB Burkholderia pseudomallei». Прикладная и экологическая микробиология. 75 (19): 6062–6075. Дои:10.1128 / aem.00820-09. ISSN  0099-2240. ЧВК  2753064. PMID  19648360.
  12. ^ Блохлингер, К; Диггельманн, Х (декабрь 1984 г.). «Фосфотрансфераза гигромицина B в качестве селектируемого маркера для экспериментов по переносу ДНК с клетками высших эукариот». Молекулярная и клеточная биология. 4 (12): 2929–2931. Дои:10.1128 / mcb.4.12.2929. ISSN  0270-7306. ЧВК  369308. PMID  6098829.
  13. ^ Каррер, Хелайн; Хокенберри, Тиш Ноэль; Сваб, Зора; Малига, Пал (октябрь 1993 г.). «Устойчивость к канамицину как селектируемый маркер трансформации пластид табака». MGG Молекулярная и общая генетика. 241-241 (1–2): 49–56. Дои:10.1007 / bf00280200. ISSN  0026-8925. PMID  8232211. S2CID  2291268.
  14. ^ Гилбертсон, Ларри (декабрь 2003 г.). «Cre – lox-рекомбинация: творческие инструменты для биотехнологии растений». Тенденции в биотехнологии. 21 (12): 550–555. Дои:10.1016 / j.tibtech.2003.09.011. ISSN  0167-7799. PMID  14624864.
  15. ^ Ган, Вэнь-Бяо; Груцендлер, Хайме; Вонг, Вай Тонг; Вонг, Рэйчел О.Л .; Лихтман, Джефф В (2000). «Многоцветная» диолистическая «маркировка нервной системы с использованием комбинаций липофильных красителей». Нейрон. 27 (2): 219–25. Дои:10.1016 / S0896-6273 (00) 00031-3. PMID  10985343. S2CID  16962732.
  16. ^ Прайтис, Вида (2006). «Создание трансгенных линий с использованием методов бомбардировки микрочастицами». К. Элеганс. Методы молекулярной биологии. 351. С. 93–108. Дои:10.1385/1-59745-151-7:93. ISBN  978-1-59745-151-2. PMID  16988428.
  17. ^ а б Сэнфорд, Джон (28 апреля 2006 г.). «Биолистическая трансформация растений». Physiologia Plantarum. 79 (1): 206–209. Дои:10.1111 / j.1399-3054.1990.tb05888.x.
  18. ^ Киккерт, Джули; Видаль, Хосе; Райш, Брюс (2005). Стабильная трансформация растительных клеток с помощью бомбардировки частицами / биоистики. Методы молекулярной биологии. 286. С. 61–78. Дои:10.1385/1-59259-827-7:061. ISBN  978-1-59259-827-4. PMID  15310913. S2CID  44395352.
  19. ^ Хейворд, доктор медицины; Bosemark, N.O .; Ромагоса, Т. (2012). Селекция растений: принципы и перспективы. Springer Science & Business Media. п. 131. ISBN  9789401115247.

дальнейшее чтение

  • О'Брайен, Дж; Холт, М; Уайтсайд, G; Ламмис, Южная Каролина; Гастингс, MH (2001). «Модификации ручного генного пистолета: усовершенствования для биологической трансфекции in vitro органотипической нейрональной ткани». Журнал методов неврологии. 112 (1): 57–64. Дои:10.1016 / S0165-0270 (01) 00457-5. PMID  11640958. S2CID  30561105.

внешняя ссылка