Джин нокаут - Gene knockout

А нокаут гена (сокращение: KO) это генетический техника, в которой один из организм с гены выведен из строя («выбит» из организма). Однако KO может также относиться к гену, который отключен, или к организму, который несет этот ген. Нокаут-организмы или просто нокауты используются для изучения функции генов, обычно путем изучения эффекта потери генов. Исследователи делают выводы из разницы между организмом с нокаутом и нормальными людьми.

Техника нокаутов по сути противоположна генная нокаутация. Одновременное отключение двух генов в организме известно как двойной нокаут (DKO). Аналогично условия тройной нокаут (Технический нокаут) и четверные нокауты (QKO) используются для описания трех или четырех нокаутированных генов соответственно. Однако нужно различать гетерозиготные и гомозиготные КО. В первом случае только одна из двух копий гена (аллели ) выбито, в последнем выбиты оба.

Методы

Нокауты достигаются с помощью различных техник. Первоначально встречающиеся в природе мутации были идентифицированы, и затем необходимо было установить потерю или инактивацию гена Секвенирование ДНК или другими способами.[1]

Лабораторная мышь, у которой был отключен ген, влияющий на рост волос (слева), показана рядом с нормальной лабораторной мышью.

Гомологичная рекомбинация

Основная статья: Гомологичная рекомбинация

Традиционно гомологичная рекомбинация был основным методом нокаута гена. Этот метод предполагает создание Конструкция ДНК содержащий желаемую мутацию. Для целей нокаута это обычно включает маркер устойчивости к лекарственному средству вместо желаемого гена нокаута.[2] Конструкция также будет содержать минимум 2 КБ гомология к целевой последовательности.[2] Конструкция может быть доставлена ​​в стволовые клетки либо через микроинъекция или электропорация.[2] Затем этот метод полагается на собственные механизмы восстановления клетки для рекомбинации конструкции ДНК в существующую ДНК. Это приводит к изменению последовательности гена, и в большинстве случаев ген будет переведено в нефункциональный белок, если он вообще переведен. Однако это неэффективный процесс, поскольку на гомологичную рекомбинацию приходится всего 10−2 до 10-3 интеграции ДНК.[2][3] Часто маркер выбора лекарственного средства на конструкции используется для отбора клеток, в которых произошло событие рекомбинации.

Дикого типа Физкомитрелла и нокаутные мхи: Отклонение фенотипы индуцированы в трансформантах библиотеки с нарушением генов. Физкомитрелла дикого типа и трансформированные растения выращивали на минимальной среде Кнопа для индукции дифференцировки и развития гаметофоры. Для каждого растения показаны обзор (верхний ряд; масштабная полоса соответствует 1 мм) и крупный план (нижний ряд; масштабная полоса равна 0,5 мм). A: Гаплоидный мох дикого типа, полностью покрытый лиственными гаметофорами, и крупный план листа дикого типа. B – D: разные мутанты.[4]

Эти стволовые клетки, лишенные гена, могут быть использованы. in vivo, например, у мышей, вставляя их в ранние эмбрионы.[2] Если полученная химерная мышь содержала генетическое изменение в их зародышевой линии, это могло быть передано потомству.[2]

В диплоид организмов, которые содержат два аллели для большинства генов, которые также могут содержать несколько связанных генов, которые сотрудничают в одной и той же роли, выполняются дополнительные раунды трансформации и отбора до тех пор, пока не будет выбит каждый целевой ген. Селекция может потребоваться произвести гомозиготный нокаутирующие животные.

Сайт-специфичные нуклеазы

Рис. 1. Мутация сдвига рамки считывания в результате делеции одной пары оснований, вызывающая изменение аминокислотной последовательности и преждевременного стоп-кодона.

В настоящее время используются три метода, которые включают точное нацеливание на последовательность ДНК с целью введения двухцепочечного разрыва. Как только это произойдет, механизмы восстановления клетки будут пытаться восстановить этот двухцепочечный разрыв, часто через негомологичное соединение концов (NHEJ), который включает прямое лигирование двух отрезанных концов вместе.[3] Это может быть сделано несовершенно, поэтому иногда возникают вставки или делеции пар оснований, что вызывает мутации сдвига рамки считывания. Эти мутации могут сделать ген, в котором они происходят, нефункциональным, что приведет к нокауту этого гена. Этот процесс более эффективен, чем гомологичная рекомбинация, и поэтому его легче использовать для создания двуаллельных нокаутов.[3]

Цинковые пальцы

Основная статья: Нуклеаза цинкового пальца

Нуклеазы цинковых пальцев состоят из ДНК-связывающих доменов, которые могут точно нацеливаться на последовательность ДНК.[3] Каждый цинковый палец может распознавать кодоны желаемой последовательности ДНК и, следовательно, может быть модульно собран для связывания с конкретной последовательностью.[5] Эти связывающие домены связаны с эндонуклеаза рестрикции что может вызвать двухцепочечный разрыв (DSB) в ДНК.[3] Процессы восстановления могут привести к мутациям, нарушающим функциональность гена.

ТАЛЕНС

Основная статья: Эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции

Эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (ТАЛЕНЫ ) также содержат ДНК-связывающий домен и нуклеазу, способную расщеплять ДНК.[6] Область связывания ДНК состоит из аминокислотных повторов, каждый из которых распознает одну пару оснований желаемой целевой последовательности ДНК.[5] Если это расщепление нацелено на кодирующую область гена, а репарация, опосредованная NHEJ, вводит вставки и делеции, часто возникает мутация сдвига рамки считывания, нарушая, таким образом, функцию гена.[6]

CRISPR / Cas9

Основная статья: CRISPR

Сгруппированные через регулярные промежутки короткие палиндромные повторы (CRISPR ) / Cas9 - это метод редактирования генома, содержащий направляющая РНК в комплексе с Cas9 белок.[5] Направляющая РНК может быть сконструирована так, чтобы соответствовать желаемой последовательности ДНК посредством простого комплементарного спаривания оснований, в отличие от трудоемкой сборки конструкций, необходимой для «цинковых пальцев» или TALEN.[7] Спаренный Cas9 вызовет двухцепочечный разрыв ДНК.[5] Следуя тому же принципу, что и «цинковые пальцы» и TALEN, попытки восстановить эти двухцепочечные разрывы часто приводят к мутациям сдвига рамки считывания, которые приводят к нефункциональному гену.[5]

Стучать

Основная статья: Джин стучит

Джин стучит похож на нокаут гена, но заменяет один ген другим вместо его удаления.

Типы

Условные нокауты

Основная статья: Условный нокаут гена

Условный нокаут гена делает возможным удаление гена в ткани в зависимости от времени. Это требуется вместо нокаута гена, если нулевая мутация приведет к эмбриональная смерть.[8] Это делается путем введения коротких последовательностей, называемых сайтами loxP, вокруг гена. Эти последовательности будут введены в зародышевую линию посредством того же механизма, что и нокаут. Затем эту зародышевую линию можно скрестить с другой зародышевой линией, содержащей Cre-рекомбиназа который является вирусным ферментом, который может распознавать эти последовательности, рекомбинировать их и удаляет ген, фланкированный этими сайтами.

Использовать

А нокаутирующая мышь (слева), это модель ожирения по сравнению с нормальной мышью.

Нокауты в основном используются для понимания роли конкретного ген или ДНК регион путем сравнения нокаута организм к дикого типа с аналогичным генетический задний план.

Выбить организмы также используются как скрининг инструменты в разработке наркотики, чтобы ориентироваться на конкретные биологические процессы или недостатки используя конкретный нокаут, или чтобы понять механизм действия из препарат, средство, медикамент используя библиотека нокаута организмы охватывающий весь геном, например, в Saccharomyces cerevisiae.[9]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Гриффитс AJ, Миллер JH, Suzuki DT, Левонтин WC, Гелбарт WM (2000). Введение в генетический анализ (7-е изд.). Нью-Йорк: У. Х. Фриман. ISBN  978-0-7167-3771-1.
  2. ^ а б c d е ж Холл, Брэдфорд; Лимае, Адвайт; Кулкарни, Ашок Б. (01.09.2009). Обзор: поколение мышей с нокаутом генов. Текущие протоколы в клеточной биологии. 44. Вили-Блэквелл. С. Раздел 19.12 19.12.1–17. Дои:10.1002 / 0471143030.cb1912s44. ISBN  978-0471143031. ЧВК  2782548. PMID  19731224.
  3. ^ а б c d е Сантьяго, Иоланда; Чан, Эдмонд; Лю, Пэй-Ци; Орландо, Сальваторе; Чжан, Линь; Урнов, Федор Д .; Холмс, Майкл С .; Гущин Дмитрий; Уэйт, Адам (2008-04-15). «Целенаправленный нокаут гена в клетках млекопитающих с использованием сконструированных нуклеаз типа« цинковые пальцы »». Труды Национальной академии наук. 105 (15): 5809–5814. Дои:10.1073 / pnas.0800940105. ISSN  0027-8424. ЧВК  2299223. PMID  18359850.
  4. ^ Эгенер Т., Гранадо Дж., Гиттон М., Хохе А., Холторф Х., Лухт Дж. М. и др. (2002). «Высокая частота фенотипических отклонений у растений Physcomitrella patens, трансформированных библиотекой генных нарушений». BMC Биология растений. 2 (1): 6. Дои:10.1186/1471-2229-2-6. ЧВК  117800. PMID  12123528.
  5. ^ а б c d е Гай, Томас; Герсбах, Чарльз А .; Барбас, Карлос Ф. (2013). «Методы на основе ZFN, TALEN и CRISPR / Cas для геномной инженерии». Тенденции в биотехнологии. 31 (7): 397–405. Дои:10.1016 / j.tibtech.2013.04.004. ЧВК  3694601. PMID  23664777.
  6. ^ а б Джунг, Дж. Кейт; Сандер, Джеффри Д. (январь 2013 г.). «TALENs: широко применяемая технология для целевого редактирования генома». Обзоры природы Молекулярная клеточная биология. 14 (1): 49–55. Дои:10.1038 / nrm3486. ISSN  1471-0080. ЧВК  3547402. PMID  23169466.
  7. ^ Ни, Вэй; Цяо, Цзюнь; Ху, Шэнвэй; Чжао, Синься; Реговский, Миша; Ян, Мин; Полежаева Ирина А .; Чен, Чуанфу (04.09.2014). «Эффективный нокаут генов у коз с использованием системы CRISPR / Cas9». PLOS ONE. 9 (9): e106718. Дои:10.1371 / journal.pone.0106718. ISSN  1932-6203. ЧВК  4154755. PMID  25188313.
  8. ^ Ле Юньчжэн; Зауэр, Брайан (2001-03-01). «Условный нокаут гена с использованием рекомбиназы cre». Молекулярная биотехнология. 17 (3): 269–275. Дои:10.1385 / МБ: 17: 3: 269. ISSN  1073-6085. PMID  11434315.
  9. ^ "YeastDeletionWebPages". Получено 21 февраля 2017.

внешние ссылки