Cre рекомбиназа - Cre recombinase

Смотрите также: Cre-Lox рекомбинация
Cre рекомбиназа
CreRecImage (DNASUBSTRATE) .png
Структура фермента (димера) рекомбиназы Cre, связанного с его субстратной ДНК
Идентификаторы
ОрганизмЭнтеробактерии фаг P1
СимволCre
Entrez2777477
RefSeq (Prot)YP_006472.1
UniProtP06956
Прочие данные
Номер ЕС2.7.7.-
Хромосомагеном: 0-0 Мб

Cre рекомбиназа тирозин-рекомбиназа фермент полученный из Бактериофаг P1. Фермент использует топоизомераза I -подобный механизм для выполнения сайт-специфическая рекомбинация События. Фермент (38 кДа) входит в состав интегрировать семейство сайт-специфичных рекомбиназ, и известно, что они катализируют сайт-специфическая рекомбинация событие между двумя сайтами узнавания ДНК (Сайты LoxP ). Этот сайт узнавания loxP из 34 пар оснований (п.н.) состоит из двух п.н. палиндромные последовательности которые фланкируют спейсерную область размером 8 пар оснований. Продукция Cre-опосредованная рекомбинация на сайтах loxP зависят от расположения и относительной ориентации сайтов loxP. Два отдельных вида ДНК, оба из которых содержат сайты loxP, могут подвергаться слиянию в результате рекомбинации, опосредованной Cre. Последовательности ДНК, обнаруженные между двумя сайтами loxP, называются "флоксированный ". В этом случае продукты рекомбинации, опосредованной Cre, зависят от ориентации сайтов loxP. ДНК, обнаруженная между двумя сайтами loxP, ориентированными в одном направлении, будет вырезана как кольцевая петля ДНК, в то время как ДНК будет вставлена ​​между двумя сайтами loxP, расположенными в противоположных направлениях. ориентированный будет перевернут.[1] Фермент не требует дополнительных кофакторов (таких как АТФ ) или вспомогательные белки для своей функции.[2]

Фермент играет важную роль в жизненном цикле Бактериофаг P1 таких как циклизация линейного генома и разрешение димерных хромосомы эта форма после Репликация ДНК.[3]

Cre-рекомбиназа - широко используемый инструмент в области молекулярная биология. Уникальная и специфическая система рекомбинации фермента используется для манипулирования генами и хромосомами в огромном диапазоне исследований, таких как ген нокаут или вбить исследования. Способность фермента эффективно работать в широком диапазоне клеточных сред (включая млекопитающих, растения, бактерии и дрожжи) позволяет Cre-Lox рекомбинация Система может использоваться в огромном количестве организмов, что делает ее особенно полезным инструментом в научных исследованиях.[4]

Открытие

Исследования, проведенные в 1981 году Штернбергом и Гамильтоном, продемонстрировали, что бактериофаг «P1» обладает уникальной системой сайт-специфической рекомбинации. EcoRI фрагменты Бактериофаг P1 геном были созданы и клонированный в лямбда-векторы. 6,5 КБ EcoRI Было обнаружено, что фрагмент (фрагмент 7) допускает эффективные события рекомбинации.[5] Было известно, что механизм этих событий рекомбинации уникален, поскольку они происходят в отсутствие бактериального RecA и RecBCD белки. Компоненты этой системы рекомбинации были выяснены с использованием делеции мутагенез исследования. Эти исследования показали, что и продукт гена P1, и сайт рекомбинации необходимы для того, чтобы произошла эффективная рекомбинация. Продукт гена P1 был назван Cre (cаусы повторнокомбинация), а сайт рекомбинации был назван loxP (вотместо пересечения (Икс) над, п1).[5] Белок Cre был очищен в 1983 году, и было обнаружено, что он составляет 35000 Да.[2] Никаких высокоэнергетических кофакторов, таких как АТФ или дополнительные белки необходимы для рекомбиназной активности очищенного белка.[2] Ранние исследования также продемонстрировали, что Cre связывается с неспецифическими последовательностями ДНК, имея при этом в 20 раз более высокую аффинность к последовательностям loxP и результаты раннего ДНК-след исследования также показали, что молекулы Cre связывают сайты loxP как димеры.[2]

Мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Вид сбоку
Мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Аминоконцевой домен показан синим, а карбоксильный домен - зеленым. (Вид сбоку)
Мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Голова на виду
Мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Аминоконцевой домен показан синим, а карбоксильный домен - зеленым. (Голова на виду)
Члены семейства тирозин-рекомбиназы[3]
S.cerevisiae Рекомбиназа flp
Бактериальная рекомбиназа XerC
Бактериальная рекомбиназа XerD
белок интегразы λ
Белок интегразы HP1

Структура

Cre-рекомбиназа состоит из 343 аминокислоты которые образуют два разных домена. В аминоконцевой домен включает остатки 20–129, и этот домен содержит 5 альфа спиральный сегменты связаны серией коротких петель. Спирали A и E участвуют в образовании тетрамера рекомбиназы с С-концевой областью спирали Е, которая, как известно, образует контакты с С-концевым доменом соседних субъединиц. Спирали B и D образуют прямые контакты с большой бороздкой ДНК loxP. Считается, что эти две спирали образуют три прямых контакта с основаниями ДНК в сайте loxP. В карбоксильный конец домен фермента состоит из аминокислот 132–341 и содержит активный сайт фермента. Общая структура этого домена имеет большое структурное сходство с каталитический домен других ферментов того же семейства, таких как интеграза λ и интеграза HP1. Этот домен имеет преимущественно спиральную структуру с 9 отдельными спиралями (F-N). Концевая спираль (N) выступает из основной части карбокси-домена, и считается, что эта спираль играет роль в опосредовании взаимодействий с другими субъединицами. Кристаллические структуры демонстрируют, что эта терминальная спираль N погружает свою гидрофобную поверхность в акцепторный карман соседней субъединицы Cre.[6]

Эффект двухдоменной структуры заключается в формировании C-образного зажима, который захватывает ДНК с противоположных сторон.[3]

Активный сайт

Мультяшная модель активного сайта Cre-рекомбиназы. Фермент связан со своим субстратом (ДНК).
На этой мультипликационной модели рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК), аминокислоты, участвующие в активном центре, показаны красным цветом и помечены. Это изображение создается после расщепления ДНК.

В активный сайт фермента Cre состоит из консервированных каталитическая триада остатки Arg 173, Его 289, Arg 292, а также консервированные нуклеофильный остатки Тюр 324 и Trp 315. В отличие от некоторых ферментов рекомбиназы, таких как рекомбиназа Flp, Cre не образует общий активный сайт между отдельными субъединицами, и все остатки, которые вносят вклад в активный сайт, находятся в одной субъединице. Следовательно, когда две молекулы Cre связываются в одном сайте loxP, присутствуют два активных сайта. Cre-опосредованная рекомбинация требует образования синапса, в котором два комплекса Cre-LoxP связываются с образованием того, что известно как тетрамер синапса, в котором присутствуют 4 различных активных сайта.[6] Тюр 324 действует как нуклеофил с образованием ковалентной 3’-фосфотирозиновой связи с ДНК-субстратом. В ножницы фосфат (фосфат, нацеленный на нуклеофильную атаку на сайт расщепления) координируется боковыми цепями 3 аминокислота остатки каталитическая триада (Arg 173, Его 289 & Trp 315). В индол азот из триптофан 315 также образует водородная связь к этому ножницеобразному фосфату. (n.b A Гистидин занимает этот сайт у других членов семейства тирозин-рекомбиназ и выполняет ту же функцию). Эта реакция расщепляет ДНК и освобождает 5’-гидроксильную группу. Этот процесс происходит в активном центре двух из четырех субъединиц рекомбиназы, присутствующих в тетрамере синапса. Если 5’-гидроксильные группы атакуют 3’-фосфотирозиновую связь, одна пара нитей ДНК обменивается с образованием Холлидей Джанкшн промежуточный.[3]

Приложения

Роль в бактериофаге P1

Cre-рекомбиназа играет важную роль в жизненный цикл из Бактериофаг P1. При инфицировании клетки система Cre-loxP используется для того, чтобы вызвать циркуляризацию ДНК P1. В дополнение к этому Cre также используется для разделения димерной лизогенной ДНК P1, которая образуется во время клеточного деления фага.[7]

Использование в исследованиях

Простота и надежность систем Cre-loxP позволили ученым использовать фермент Cre для манипулирования ДНК как in vivo, так и in vitro. Увидеть Рекомбинация Cre-Lox Больше подробностей. Фермент Cre может экспрессироваться во многих различных организмах, таких как растения, бактерии, млекопитающие, дрожжи. В 1992 году Cre был экспрессирован и обнаружен, что он функционирует в организме мыши-хозяина.[8][9] Промоутер областями можно манипулировать для обеспечения точного временного контроля экспрессии фермента Cre (например, химерного регулятора GLVP, чувствительного к RU486).[10] Поскольку фермент имеет специфический ДНК-субстрат размером 34 пн, геном организма должен быть 1018 п.н. в длину, чтобы, вероятно, иметь место сайт loxP. Поскольку геномы млекопитающих в среднем находятся в районе 3×109 bp очень мала вероятность найти эндогенный loxP сайт.[1] Чтобы Cre работал на чужом хосте, экзогенный Сайты loxP должны быть спроектированы. Это позволяет точно контролировать активность фермента Cre в тестовых организмах.

Независимо, Джо З. Цзянь является пионером в использовании системы Cre-loxP для нейробиологических исследований с целью манипулирования генами, зависящими от типа и региона клеток, в мозге взрослого человека, где могут существовать сотни различных типов нейронов, и почти все нейроны в мозге взрослого человека находятся в постмитотическом состоянии. Цзянь и его коллеги продемонстрировали, что Cre-обусловленная рекомбинация может происходить в постмитотических пирамидных нейронах переднего мозга взрослых мышей.[11] Явная демонстрация его полезности в точном определении сложных отношений между конкретными клетками / цепями и поведением для исследования мозга,[12] способствовал тому, что NIH инициировал проект NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre-driver для мышей в начале 2000 года.[13][14] На сегодняшний день в рамках проекта NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre создано несколько сотен линий мыши с драйверами Cre, которые в настоящее время используются мировым сообществом нейробиологов.

Улучшения

В последние годы рекомбиназа Cre была усовершенствована путем превращения ее в предпочтительную форму млекопитающих кодоны, удаление сообщенных загадочных сайты сращивания, измененный стоп-кодон, и уменьшил CpG контент для снижения риска эпигенетических заглушить в млекопитающие.[15] Также был идентифицирован ряд мутантов с повышенной точностью.[16]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ а б Надь А. (февраль 2000 г.). «Cre-рекомбиназа: универсальный реагент для адаптации генома». Бытие. 26 (2): 99–109. Дои:10.1002 / (SICI) 1526-968X (200002) 26: 2 <99 :: AID-GENE1> 3.0.CO; 2-B. PMID  10686599.
  2. ^ а б c d Абремски К., Хесс Р. (февраль 1984 г.). «Сайт-специфическая рекомбинация бактериофага P1. Очистка и свойства белка рекомбиназы Cre». Журнал биологической химии. 259 (3): 1509–1514. PMID  6319400.
  3. ^ а б c d Ван Дайн Г.Д. (2001). «Структурный вид сайт-специфической рекомбинации cre-loxp». Ежегодный обзор биофизики и структуры биомолекул. 30: 87–104. Дои:10.1146 / annurev.biophys.30.1.87. PMID  11340053.
  4. ^ Эннифар Э., Мейер Дж. Э., Бухгольц Ф., Стюарт А.Ф., Suck D (сентябрь 2003 г.). «Кристаллическая структура синапса Cre-рекомбиназа-loxP дикого типа демонстрирует новую конформацию спейсера, предполагающую альтернативный механизм активации расщепления ДНК». Исследования нуклеиновых кислот. 31 (18): 5449–5460. Дои:10.1093 / нар / gkg732. ЧВК  203317. PMID  12954782.
  5. ^ а б Штернберг Н., Гамильтон Д. (август 1981 г.). "Сайт-специфическая рекомбинация бактериофага P1. I. Рекомбинация между сайтами loxP". Журнал молекулярной биологии. 150 (4): 467–486. Дои:10.1016/0022-2836(81)90375-2. PMID  6276557.
  6. ^ а б Гуо Ф., Гопаул Д. Н., ван Дайн Г. Д. (сентябрь 1997 г.). «Структура Cre-рекомбиназы в комплексе с ДНК в синапсе сайт-специфической рекомбинации». Природа. 389 (6646): 40–46. Bibcode:1997 Натур.389 ... 40G. Дои:10.1038/37925. PMID  9288963.
  7. ^ Шейх А.С., Садовски П.Д. (февраль 1997 г.). «Рекомбиназа Cre расщепляет сайт lox в транс». Журнал биологической химии. 272 (9): 5695–5702. Дои:10.1074 / jbc.272.9.5695. PMID  9038180.
  8. ^ Лаксо М., Зауэр Б., Мосинджер Б., Ли Э. Дж., Мэннинг Р. У., Ю Ш., Малдер К. Л., Вестфаль Г. (июль 1992 г.). «Нацеленная активация онкогенов посредством сайт-специфической рекомбинации у трансгенных мышей». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 89 (14): 6232–6236. Bibcode:1992ПНАС ... 89.6232Л. Дои:10.1073 / pnas.89.14.6232. ЧВК  49474. PMID  1631115.
  9. ^ Orban PC, Chui D, Marth JD (август 1992 г.). «Тканевая и сайт-специфическая рекомбинация ДНК у трансгенных мышей». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 89 (15): 6861–6865. Bibcode:1992 ПНАС ... 89.6861O. Дои:10.1073 / пнас.89.15.6861. ЧВК  49604. PMID  1495975.
  10. ^ Kyrkanides S, Miller JH, Bowers WJ, Federoff HJ (ноябрь 2003 г.). «Транскрипционная и посттрансляционная регуляция рекомбиназы Cre посредством RU486 как основа для усиленной индуцибельной системы экспрессии». Молекулярная терапия. 8 (5): 790–795. Дои:10.1016 / j.ymthe.2003.07.005. PMID  14599812.
  11. ^ Цзянь и др. (1996). «Нокаут гена, ограниченного субрегиональным и клеточным типом, в мозге мышей». Ячейка. 87 (7): 1317–26. Дои:10.1016 / s0092-8674 (00) 81826-7. PMID  8980237.
  12. ^ Цзянь Дж. З. и др. (1996b). «Существенная роль синаптической пластичности, зависящей от рецептора CA1 NMDA гиппокампа в пространственной памяти». Ячейка. 87 (7): 1327–38. Дои:10.1016 / s0092-8674 (00) 81827-9. PMID  8980238.
  13. ^ План NIH для нейробиологии: сеть драйверов Cre. http://www.neuroscienceblueprint.nih.gov/factSheet/CreDriver.htm
  14. ^ Мозговой проект GENSAT, http://www.gensat.org/index.html
  15. ^ Шимшек Д.Р., Ким Дж., Хюбнер М.Р., Спергель Д.Д., Бухгольц Ф., Казанова Е., Стюарт А.Ф., Зеебург PH, Шпренгель Р. (январь 2002 г.). «Экспрессия рекомбиназы Cre с улучшенными кодонами (iCre) у мышей». Бытие. 32 (1): 19–26. Дои:10.1002 / ген.10023. PMID  11835670.
  16. ^ Ерошенко Н., Church GM (сентябрь 2013 г.). «Мутанты Cre-рекомбиназы с повышенной точностью». Nature Communications. 4: 2509. Bibcode:2013 НатКо ... 4.2509E. Дои:10.1038 / ncomms3509. ЧВК  3972015. PMID  24056590.

внешние ссылки