Флоксирование - Floxing

На этом рисунке показано, как Floxing используется в научных исследованиях для пространственного и временного контроля экспрессии генов.

В генетике флоксирование относится к сэндвичу ДНК последовательность (которая тогда называется флоксированный) между двумя lox P места. Эти термины построены на фразе «фланговый / фланговый LoxP». Рекомбинация между сайтами LoxP катализируется Cre рекомбиназа. Флоксирование гена позволяет ему быть удаленным (нокаутированным), перемещенным или инвертированным в процессе, называемом Cre-Lox рекомбинация. [1] Флоксирование генов имеет важное значение при разработке научных модельных систем, поскольку позволяет исследователям изменять экспрессию генов в пространстве и во времени.[2] Более того, животных, таких как мыши, можно использовать в качестве моделей для изучения болезней человека. Таким образом, систему Cre-lox можно использовать на мышах для управления экспрессией генов с целью изучения болезней человека и разработки лекарств.[3] Например, с помощью системы Cre-lox исследователи могут изучать онкогены и подавитель опухолей гены и их роль в развитии и прогрессировании рак в моделях мышей.[4]

Использование в исследованиях

Флоксирование гена позволяет его удалить (нокаутировать),[5][6] перемещен или вставлен[7] (через различные механизмы рекомбинации Cre-Lox).

Флоксирование генов имеет важное значение при разработке научных модельных систем, поскольку оно позволяет пространственно и временно изменять экспрессию генов. Проще говоря, ген может быть нокаутирован (инактивирован) в определенной ткани. in vivo, в любое время по выбору ученого. Затем ученый может оценить эффекты нокаутированного гена и определить нормальную функцию гена.[8]. Это отличается от отсутствия гена с момента зачатия, когда инактивация или потеря генов, необходимых для развития организма, может нарушить нормальное функционирование клеток и предотвратить образование жизнеспособного потомства.[9]

Механизм удаления

Модельный эксперимент в области генетики с использованием системы Cre-lox: последовательность преждевременной остановки, присутствующая у мышей, подвергшихся флоксированию, удаляется только из клеток, экспрессирующих рекомбиназу Cre, когда мышей скрещивают вместе.

События удаления полезны для выполнения экспериментов по редактированию генов посредством точного редактирования сегментов или даже целых генов. Удаление требует объединения интересующего сегмента с сайтами loxP, которые обращены в одном направлении. Рекомбиназа Cre будет обнаруживать однонаправленные сайты loxP и вырезать флоксированный сегмент ДНК.[10] Успешно отредактированные клоны можно выбрать с помощью маркера выбора, который можно удалить с помощью той же системы Cre-loxP.[10] Тот же механизм можно использовать для создания условные аллели путем введения FRT / Flp сайт, который выполняет тот же механизм, но с другим ферментом.

Механизм инверсии

События инверсии полезны для сохранения количества генетического материала. Инвертированные гены не часто связаны с аномальными фенотипы, что означает, что инвертированные гены в целом жизнеспособны.[11] Для рекомбинации Cre-loxP, которая приводит к вставке, требуются сайты loxP для флоксирования интересующего гена, причем сайты loxP ориентированы друг на друга. Пройдя рекомбинацию Cre, область, флоксируемая сайтами loxP, станет инвертированной,[12] этот процесс не является постоянным и может быть отменен.[13]  

Механизм транслокации

События транслокации происходят, когда loxP размещает гены flox на двух разных молекулах ДНК в однонаправленной ориентации. Затем Cre-рекомбиназа используется для создания транслокации между двумя молекулами ДНК, обменивая генетический материал от одной молекулы ДНК на другую, образуя одновременную транслокацию обоих флоксованных генов.[14][15]

Общие приложения в исследованиях

Кардиомиоциты (ткань сердечной мышцы) экспрессирует тип рекомбиназы Cre, который очень специфичен для кардиомиоцитов и может использоваться исследователями для выполнения высокоэффективных рекомбинаций. Это достигается за счет использования типа Cre, выражение которого определяется промотор тяжелой цепи миозина (-MyHC). Эти рекомбинации способны разрушать гены способом, специфичным только для сердечной ткани. in vivo и позволяет создавать условные нокауты сердца, в основном для использования в качестве контроля.[16]

Например, используя Cre рекомбиназа с -Промотор MyHC вызывает инактивацию гена floxed только в сердце. Кроме того, эти выбивки могут быть индуцируемыми. В нескольких исследованиях на мышах тамоксифен используется, чтобы вызвать Cre рекомбиназа.[17][18] В этом случае, Cre рекомбиназа слита с частью мыши рецептор эстрогена (ER), который содержит мутацию в своем лиганд-связывающий домен (LBD). Мутация делает рецептор неактивным, что приводит к неправильной локализации из-за его взаимодействия с белками-шаперонами, такими как белок теплового шока 70 и 90 (Hsp70 и Hsp90 ). Тамоксифен связывается с Cre-ER и нарушает его взаимодействия с шаперонами, что позволяет слитому белку Cre-ER проникать в ядро ​​и выполнять рекомбинацию на флоксованном гене.[19][20] Кроме того, Cre рекомбиназа могут быть вызваны теплом, когда они находятся под контролем элементов удельного теплового удара (HSE).[21][22]

Рекомендации

  1. ^ Надь А. (февраль 2000 г.). «Cre-рекомбиназа: универсальный реагент для адаптации генома». Бытие. 26 (2): 99–109. Дои:10.1002 / (SICI) 1526-968X (200002) 26: 2 <99 :: AID-GENE1> 3.0.CO; 2-B. PMID  10686599. S2CID  2916710.
  2. ^ Хаяши С., МакМахон А.П. (апрель 2002 г.). «Эффективная рекомбинация в различных тканях с помощью индуцируемой тамоксифеном формы Cre: инструмент для временно регулируемой активации / инактивации генов у мышей». Биология развития. 244 (2): 305–18. Дои:10.1006 / dbio.2002.0597. PMID  11944939.
  3. ^ Генетика мышей: методы и протоколы. Сингх, Шри Рам, Коппола, Винченцо. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. ISBN  9781493912155. OCLC  885338722.CS1 maint: другие (связь)
  4. ^ Грин Дж. Э., Рид Т. (2012). Генно-инженерные мыши для исследования рака. Дои:10.1007/978-0-387-69805-2. ISBN  978-0-387-69803-8.
  5. ^ Friedel RH, Wurst W., Wefers B, Kühn R (2011). «Создание мышей с условным нокаутом». Методы и протоколы трансгенных мышей. Методы молекулярной биологии. 693. С. 205–31. Дои:10.1007/978-1-60761-974-1_12. ISBN  978-1-60761-973-4. PMID  21080282.
  6. ^ Сакамото К., Гурумурти CB, Вагнер К. (2014), Сингх С.Р., Коппола В. (ред.), «Генерация мышей с условным нокаутом», Генетика мыши, Springer Нью-Йорк, 1194, стр. 21–35, Дои:10.1007/978-1-4939-1215-5_2, ISBN  9781493912148, PMID  25064096
  7. ^ Имута Ю., Кийонари Х, Джанг Ч.В., Берингер Р.Р., Сасаки Х. (март 2013 г.). «Создание нокаутных мышей, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок с усиленным ядерным излучением и рекомбиназу Cre, индуцируемую тамоксифеном, в хорде из локусов Foxa2 и T». Бытие. 51 (3): 210–8. Дои:10.1002 / dvg.22376. ЧВК  3632256. PMID  23359409.
  8. ^ Зал B, Limaye A, Kulkarni AB (сентябрь 2009 г.). «Обзор: поколение мышей с нокаутом генов». Текущие протоколы в клеточной биологии. Глава 19: Блок 19.12 19.12.1–17. Дои:10.1002 / 0471143030.cb1912s44. ЧВК  2782548. PMID  19731224.
  9. ^ Родригес СП, Шахнович Е.И. (01.08.2019). «Адаптация к мутационной инактивации важного гена E. coli приближается к доступному субоптимальному пику приспособленности». bioRxiv: 552240. Дои:10.1101/552240.
  10. ^ а б Швенк Ф., Барон У., Раевский К. (декабрь 1995 г.). «Cre-трансгенная линия мышей с повсеместной делецией генных сегментов, фланкированных loxP, включая делецию в зародышевых клетках». Исследования нуклеиновых кислот. 23 (24): 5080–1. Дои:10.1093 / nar / 23.24.5080. ЧВК  307516. PMID  8559668.
  11. ^ Гриффитс AJ, Миллер JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (2000). «Инверсии». Введение в генетический анализ. 7-е издание.
  12. ^ Сюй Дж., Чжу Ю. (август 2018 г.). «Быстрый in vitro метод переворота двойной флоксированной перевернутой открытой рамки считывания в плазмиде». BMC Biotechnology. 18 (1): 52. Дои:10.1186 / с12896-018-0462-х. ЧВК  6119287. PMID  30170595.
  13. ^ Обердорффер П., Отипобы К.Л., Маруяма М., Раевский К. (ноябрь 2003 г.). «Однонаправленная Cre-опосредованная генетическая инверсия у мышей с использованием мутантной пары loxP lox66 / lox71». Исследования нуклеиновых кислот. 31 (22): 140e – 140. Дои:10.1093 / нар / gng140. ЧВК  275577. PMID  14602933.
  14. ^ Сюй Дж., Чжу Ю. (август 2018 г.). «Быстрый метод in vitro для переворота двойной флокированной перевернутой открытой рамки считывания в плазмиде». BMC Biotechnology. 18 (1): 52. Дои:10.1186 / с12896-018-0462-х. ЧВК  6119287. PMID  30170595.
  15. ^ Гриффитс AJ, Миллер JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (2000). «Транслокации». Введение в генетический анализ (7-е изд.).
  16. ^ Пугач Е.К., Ричмонд П.А., Азофейфа Дж. Г., Доуэлл Р.Д., Лейнванд Л.А. (сентябрь 2015 г.). «Длительная экспрессия Cre, управляемая промотором тяжелой цепи α-миозина, может быть кардиотоксичной». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии. 86: 54–61. Дои:10.1016 / j.yjmcc.2015.06.019. ЧВК  4558343. PMID  26141530.
  17. ^ Хаяши С., МакМахон А.П. (апрель 2002 г.). «Эффективная рекомбинация в различных тканях с помощью индуцируемой тамоксифеном формы Cre: инструмент для временно регулируемой активации / инактивации генов у мышей». Биология развития. 244 (2): 305–18. Дои:10.1006 / dbio.2002.0597. PMID  11944939.
  18. ^ Хаяши С., МакМахон А.П. (апрель 2002 г.). «Эффективная рекомбинация в различных тканях с помощью индуцируемой тамоксифеном формы Cre: инструмент для временно регулируемой активации / инактивации генов у мышей». Биология развития. 244 (2): 305–18. Дои:10.1006 / dbio.2002.0597. PMID  11944939.
  19. ^ Даниэлян П.С., Муччино Д., Рович Д.Х., Майкл С.К., МакМахон А.П. (декабрь 1998 г.). «Модификация активности гена в эмбрионах мышей в утробе матери с помощью индуцируемой тамоксифеном формы рекомбиназы Cre». Текущая биология. 8 (24): 1323–6. Дои:10.1016 / s0960-9822 (07) 00562-3. PMID  9843687.
  20. ^ Методы трансгенеза: принципы и протоколы. Кларк, Алан Р. (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. 2002 г. ISBN  9781592591787. OCLC  50175106.CS1 maint: другие (связь)
  21. ^ Рак и рыбки данио: механизмы, методы и модели. Лангенау, Дэвид М. Швейцария. ISBN  9783319306544. OCLC  949668674.CS1 maint: другие (связь)
  22. ^ Кобаяси К., Камей Ю., Киношита М., Черни Т., Танака М. (январь 2013 г.). «Индуцируемая нагреванием система индукции гена CRE / LOXP в медаке». Бытие. 51 (1): 59–67. Дои:10.1002 / dvg.22348. PMID  23019184.