Аланиновое сканирование - Alanine scanning

Пример сканирования аланина. Учитываются нативный белок (верхний ряд) и каждая возможная точечная мутация аланина.

В молекулярная биология, аланиновое сканирование это сайт-направленный мутагенез метод, используемый для определения вклада конкретного остатка в стабильность или функцию данного белка.[1] Аланин используется из-за его не громоздкой, химически инертной, метильной функциональной группы, которая, тем не менее, имитирует вторичная структура предпочтения, которыми обладают многие другие аминокислоты. Иногда громоздкие аминокислоты, такие как валин или лейцин используются в тех случаях, когда необходимо сохранение размера мутированных остатков.

Этот метод также можно использовать для определения того, боковая цепь конкретного остаток играет важную роль в биологическая активность. Обычно это достигается сайт-направленный мутагенез или случайно, создав ПЦР библиотека. Кроме того, были разработаны вычислительные методы оценки термодинамических параметров на основе теоретических замещений аланина.

Этот метод является быстрым, поскольку многие боковые цепи анализируются одновременно, и отпадает необходимость в очистке белка и биофизическом анализе.[2] На данный момент технология очень зрелая и широко используется в биохимических областях. Данные могут быть проверены ИК, ЯМР-спектроскопия, математические методы, биопробы и др.[3][4][5]

Хорошим примером сканирования аланина является изучение роли заряженных остатков на поверхности белков.[6] В систематическом исследовании роли консервативных заряженных остатков на поверхности эпителиального натриевого канала (ENaC ), сканирование аланином было использовано, чтобы выявить важность заряженных остатков для процесса транспорта белков к поверхности клетки.[6]

Приложения

Аланиновое сканирование использовалось для одновременного определения функционального вклада 19 боковых цепей, скрытых на границе раздела между гормоном роста человека и внеклеточным доменом его рецептора.[2] Каждая аминокислота в боковых цепях была замещена аланином. Затем метод сканирования дробовика, который объединяет концепции сканирования аланина. мутагенез и биномиальный мутагенез с технологией фагового дисплея.

Еще одно важное применение аланинового сканирования - определение влияния отдельных остатков на структуру и активность прототипа. циклотид калата B1.[3] Циклотиды проявляют широкий спектр фармацевтически важных биоактивностей, но их естественная функция заключается в защите растений в качестве инсектицидных агентов. В структуре cyclotides kalata B1 все 23 нецистеиновых остатка были последовательно замещены аланином. Данные были проверены ЯМР-спектроскопия.

Кроме того, сканирование аланином также используется для определения того, какой функциональный мотив Cry4Aa обладает москитоцидной активностью.[4] Cry4Aa был произведен Bacillus thuringiensis. Это токсин, специфичный для двукрылых, и он играет важную роль в производстве биоинсектицида для борьбы с комарами. Итак, очень важно определить, какой функциональный мотив Cry4Aa способствует этой активности. В этом исследовании несколько мутантов Cry4Aa были получены путем замены остатков потенциального сайта связывания рецептора, петель 1, 2 и 3 в домене II на аланин. Биологический анализ Culex pipiens был отслежен, чтобы проверить действия.

Модель Аланин-Мир

Метод сканирования аланином использует тот факт, что большинство канонические аминокислоты можно обменять на Ala точечными мутациями, в то время как вторичная структура мутированного белка остается неизменным, поскольку Ala имитирует предпочтения вторичной структуры большинства кодируемых или канонических аминокислот. Это предсказано Модель Аланин-Мир.

использованная литература

  1. ^ Моррисон К.Л., Вайс Г.А. (июнь 2001 г.). «Комбинаторное аланин-сканирование». Curr Opin Chem Biol. 5 (3): 302–7. Дои:10.1016 / S1367-5931 (00) 00206-4. PMID  11479122.
  2. ^ а б Вайс Г.А., Ватанабе С.К., Чжун А., Годдард А., Сидху СС (август 2000 г.). «Быстрое картирование функциональных эпитопов белков с помощью комбинаторного сканирования аланина». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 97 (16): 8950–4. Дои:10.1073 / pnas.160252097. ЧВК  16802. PMID  10908667.
  3. ^ а б Симонсен С.М., Сандо Л., Розенгрен К.Дж., Ван С.К., Колгрейв М.Л., Дейли Н.Л., Крейк Д.Д. (апрель 2008 г.). «Аланин-сканирующий мутагенез прототипного циклотида выявляет кластер остатков, необходимых для биоактивности». J. Biol. Chem. 283 (15): 9805–13. Дои:10.1074 / jbc.M709303200. PMID  18258598.
  4. ^ а б Ховладер М.Т., Кагава Ю., Миякава А., Ямамото А., Танигучи Т., Хаякава Т., Сакаи Х. (февраль 2010 г.). «Аланиновый сканирующий анализ трех основных петель в домене II Bacillus thuringiensis против москитоцидного токсина Cry4Aa». Appl. Environ. Микробиол. 76 (3): 860–5. Дои:10.1128 / AEM.02175-09. ЧВК  2813026. PMID  19948851.
  5. ^ Гоген Л., Делейн С., Альвино С.Л., Макнил К.А., Уоллес Дж.С., Форбс Б.Э., Де Мейтс П. (июль 2008 г.). «Аланиновое сканирование предполагаемой поверхности связывания рецептора инсулиноподобного фактора роста-I». J. Biol. Chem. 283 (30): 20821–9. Дои:10.1074 / jbc.M802620200. ЧВК  3258947. PMID  18502759.
  6. ^ а б Эдельхейт О, Ханукоглу И., Даскаль Н., Ханукоглу А. (апрель 2011 г.). «Определение роли консервативных заряженных остатков во внеклеточном домене субъединицы эпителиального натриевого канала (ENaC) с помощью аланинового мутагенеза». Am. J. Physiol. Почечная физиология. 300 (4): F887–97. Дои:10.1152 / ajprenal.00648.2010. PMID  21209000.

дальнейшее чтение

  • Михельс CA (2002). Генетические методы для биологических исследований: тематический подход. Лондон: Дж. Вили. п. 111. ISBN  978-0-471-89921-1.