Клоногенный анализ - Википедия - Clonogenic assay

А клоногенный анализ это метод клеточной биологии для изучения эффективности конкретных агентов на выживание и пролиферацию клеток. Часто используется в исследования рака лаборатории для определения влияния лекарств или радиации на распространение опухоль клетки[1] а также для титрования частиц, убивающих клетки (CKP) в вирусных запасах.[2] Впервые он был разработан T.T. Puck и Филипп I. Маркус в Университете Колорадо в 1955 году.[3]

Хотя этот метод может обеспечить точные результаты, анализ требует много времени для настройки и анализа и может предоставить данные только о опухолевых клетках, которые могут расти в культуре. Слово «клоногенные» относится к тому факту, что эти клетки клоны друг друга.

Процедура

Эксперимент включает три основных этапа:

  1. Обработка применяется к образцу клеток.
  2. Ячейки «покрыты» культура ткани сосуд и дали расти.
  3. Полученные колонии фиксируют, окрашивают и подсчитывают.

По завершении эксперимента процент клеток, которые выжили после обработки. Графическое представление выживаемости в зависимости от концентрации препарата или дозы ионизирующего излучения называется кривая выживаемости клеток.[4]

За Анализ частиц, убивающих клетки, выжившая фракция клеток используется для аппроксимации распределения Пуассона вирусных частиц среди клеток и, следовательно, для определения количества CKPs встречается каждой ячейкой.

Любой тип клетка могут быть использованы в эксперименте, но поскольку целью этих экспериментов в онкологических исследованиях является открытие более эффективных методов лечения рака, опухолевые клетки человека являются типичным выбором. Клетки происходят либо из подготовленных «клеточных линий», которые были хорошо изучены и общие характеристики которых известны, либо из биопсия опухоли у пациента.[5] Ячейки вставлены чашки Петри или в планшетах, содержащих несколько круглых «лунок». В зависимости от эксперимента засевают определенное количество клеток; в эксперименте с облучением обычно наносят большее количество клеток с увеличением дозы облучения. Например, в дозе 0 или 1 серый радиации, 500 клеток могут быть посеяны, но на 4 или 5 серых, 2500 может быть посеяно, так как очень большое количество клеток погибает на этом уровне радиации, и эффекты специфической обработки будут ненаблюдаемыми.

Подсчет колоний клеток обычно проводится под микроскоп и довольно утомительно. Недавно были разработаны машины, использующие алгоритмы анализировать изображения.[6] Они либо захвачены сканер изображений или автоматизированный микроскоп, который может полностью автоматизировать процесс подсчета.[7] Одна из таких автоматических машин работает, принимая определенные типы клеточных пластин через прорезь (в отличие от проигрывателя компакт-дисков), делая фотографию и загружая ее в компьютер для немедленного анализа. Надежные подсчеты доступны в секундах.

Переменные

Лечение обычно препарат, средство, медикамент, ионизирующего излучения, или их комбинация.[8] Некоторые текущие исследования изучают усиление действия лекарств при одновременном облучении - a синергетический эффект - и в этой ситуации изучаются две группы: контрольная группа, которая не лечится препаратом; и группа лечения, которая лечится препаратом. Облучены обе группы. Если наклон их кривых выживания значительно различается, то может быть очевиден потенцирующий эффект, и его можно будет изучить дополнительно. Поскольку многие опухолевые клетки не будут выращивать колонии в культуре, анализ пролиферации клеток, который, как сообщается, имеет удовлетворительную точность при измерении синергетических эффектов между ионизирующим излучением и лекарствами, может использоваться в качестве суррогата. [9]

Подробное обсуждение многообещающих исследований, проводимых с помощью этой техники, выходит за рамки этого текста, но некоторые исследования затрагивают эффект выражения конкретных гены или же рецепторы на клетку, ответы разных типов клеток или синергетические эффекты нескольких лекарств.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Хоффман, Роберт М. (1991). «Тесты чувствительности in vitro при раке: обзор, анализ и прогноз». Журнал клинического лабораторного анализа. 5 (2): 133–43. Дои:10.1002 / jcla.1860050211. PMID  2023059.
  2. ^ Ngunjiri, J.M .; Секеллик, М. Дж .; Маркус, П. И. (2008). «Клоногенный анализ вирусов гриппа типа А выявляет неинфекционные частицы, убивающие клетки (индуцирующие апоптоз)». Журнал вирусологии. 82 (6): 2673–80. Дои:10.1128 / JVI.02221-07. ЧВК  2258965. PMID  18184709.
  3. ^ Стенограмма интервью TWiV @http://www.twiv.tv/TWiV197-082612.pdf
  4. ^ Франкен, Николаас А. П.; Родермонд, Ганс М; Стэп, Ян; Хавеман, Яап; Ван Бри, Крис (2006). «Клоногенный анализ клеток in vitro». Протоколы природы. 1 (5): 2315–9. Дои:10.1038 / nprot.2006.339. PMID  17406473.
  5. ^ Гамбург, Энн В. (1987). «Клоногенный анализ опухоли человека как модельная система в клеточной биологии». Международный журнал клонирования клеток. 5 (2): 89–107. Дои:10.1002 / шток.5530050202.
  6. ^ Ниязи, Максимилиан; Ниязи, Исмат; Белка, Клаус (2007). «Подсчет колоний в клоногенных анализах с использованием денситометрического программного обеспечения». Радиационная Онкология. 2: 4. Дои:10.1186 / 1748-717X-2-4. ЧВК  1770926. PMID  17212832.
  7. ^ Дале, Йостейн; Какар, Маниш; Steen, Harald B .; Калхус, Олав (2004). «Автоматический подсчет колоний клеток млекопитающих с помощью плоского сканера и обработки изображений». Цитометрия. 60А (2): 182–8. Дои:10.1002 / cyto.a.20038.
  8. ^ Карни, DN; Винклер, CF (1985). «Тесты химиотерапевтической чувствительности in vitro». Важные достижения в онкологии: 78–103. PMID  3916747.
  9. ^ Лю, Q; Мэн, В. (2015). «Адаптация платформы для скрининга лекарств для обнаружения ассоциаций молекулярно-направленных радиосенсибилизаторов с геномными биомаркерами». Молекулярные исследования рака. 13: 713–720. Дои:10.1158 / 1541-7786.MCR-14-0570. ЧВК  4410013. PMID  25667133.