ДНК-направленная интерференция РНК - DNA-directed RNA interference

ДНК-направленная интерференция РНК (ддРНКи) это подавление генов метод, который использует конструкции ДНК для активации эндогенных клеток животных. РНК-интерференция (РНКи) пути. Конструкции ДНК предназначены для экспрессии самокомплементарных двухцепочечных РНК, обычно коротких шпилечных РНК (shRNA ), которые после обработки вызывают молчание целевого гена или генов.[1] Любая РНК, включая эндогенные мРНК или вирусные РНК, может быть подавлена ​​путем создания конструкций для экспрессии двухцепочечной РНК, комплементарной желаемой. мРНК цель.

Этот механизм имеет большой потенциал в качестве нового терапевтического средства для подавления болезней генов. Подтверждение концепции было продемонстрировано на ряде моделей заболеваний, включая вирусные заболевания, такие как ВИЧ,[2] гепатит Б[3] или же гепатит С,[4] или заболевания, связанные с измененной экспрессией эндогенных генов, таких как лекарственно-устойчивые рак легких,[5] невропатическая боль,[6] распространенный рак [7] и пигментный ретинит.[8]

текст
Рисунок 1: механизм действия ddRNAi

механизм ddRNAi

Как видно на рисунке 1, конструкция ддРНКи, кодирующая кшРНК, упакована в комплект поставки. вектор или реагент, специально предназначенный для конкретных клеток. Внутри клетки ДНК транспортируется в ядро, где транскрипция машины постоянно производят закодированные РНК. Затем молекулы shRNA обрабатываются эндогенными системами и попадают в РНКи путь и замолчать желаемые гены.[1]

Долгосрочная деятельность

В отличие от малых интерферирующих РНК (миРНК ) терапевтических средств, которые поворачиваются внутри клетки и, следовательно, только временно заглушают гены, конструкции ДНК непрерывно транскрибируются, пополняя клеточную «дозу» shРНК, тем самым обеспечивая длительное молчание генов-мишеней. Механизм ddRNAi, таким образом, предлагает потенциал для постоянной клинической пользы при меньшем медицинском вмешательстве.[2][4]

Организация конструкций ddRNAi

На рисунке 2 показан наиболее распространенный тип конструкции ДНК ddRNAi, которая предназначена для экспрессии shRNA. Он состоит из промоторной последовательности, управляющей экспрессией смысловой и антисмысловой последовательностей, разделенных последовательностью петли, за которой следует терминатор транскрипции. Антисмысловые частицы, обработанные из shRNA, могут связываться с целевой РНК и определять ее деградацию. Конструкции shRNA обычно кодируют смысловые и антисмысловые последовательности из 20-30 нуклеотидов. Возможна гибкость в конструкции конструкции: например, положения смысловой и антисмысловой последовательностей могут быть изменены, а другие модификации и добавления могут изменить процессинг внутриклеточной кшРНК.[9] Кроме того, можно использовать множество последовательностей промоторной петли и терминатора.[4]

текст
Рисунок 2: ДНК-конструкции ddRNAi

Особенно полезный вариант - это мульти-кассета (рис. 2b). Разработанные для экспрессии двух или более shРНК, они могут одновременно нацеливаться на несколько последовательностей для деградации. Это особенно полезная стратегия для борьбы с вирусами. Вариации естественной последовательности могут сделать один сайт-мишень shRNA нераспознаваемым, предотвращая деградацию РНК. Мультикассетные конструкции, нацеленные на несколько сайтов в одной и той же вирусной РНК, позволяют обойти эту проблему.[4]

Доставка

Доставка ДНК-конструкций ддРНКи упрощается благодаря наличию ряда клинически одобренных и хорошо изученных генная терапия векторы, разработанные для этой цели. Доставка является серьезной проблемой для терапии на основе РНКи, поскольку постоянно разрабатываются новые модификации и реагенты для оптимизации доставки клеток-мишеней. Доступны две широкие стратегии для облегчения доставки конструкций ДНК в желаемые клетки: в них используются либо вирусные векторы, либо один из нескольких классов трансфекция реагенты.

В естественных условиях Доставка конструкций ddRNAi была продемонстрирована с использованием ряда векторов и реагентов с различными путями введения (ROA).[3][4][6][8]

Конструкции ddRNAi также были успешно доставлены в клетки-хозяева ex vivo, а затем пересаживают обратно в хозяина.[2][7][10]

Например, в клиническом исследовании фазы I в Национальный медицинский центр "Город надежды", Калифорния, США, четыре ВИЧ-инфицированных пациента с неходжкинской лимфомой успешно прошли курс лечения аутологичной гемопоэтические клетки-предшественники предварительно трансдуцированные ex vivo конструкциями ддРНКи с использованием лентивирусных векторов. Эта конструкция была разработана для экспрессии трех терапевтических РНК, одна из которых была кшРНК, тем самым борясь с репликацией ВИЧ тремя различными способами:[2]

  • shRNA, которая заглушает гены tat и rev генома ВИЧ
  • Рибозим CCR5, ингибирующий проникновение в вирусные клетки
  • РНК-ловушка TAR, ингибирующая инициацию вирусной транскрипции.

Продолжающаяся экспрессия shРНК была подтверждена в Т-клетках, моноцитах и ​​В-клетках более чем через год после трансплантации.[2]

Терапевтические приложения

Невропатическая боль

Nervana - это исследуемая конструкция ддРНКи, которая подавляет экспрессию протеинкиназа C гамма (PKCγ), как известно, связано с невропатическая боль и толерантность к морфину.[6]

Были идентифицированы две консервативные последовательности PKCγ, обнаруженные у всех ключевых модельных видов и людей, и созданы как одиночные, так и двойные кассеты ДНК. In vitro экспрессия PKCγ подавлялась на 80%. Когда аналогичные конструкции ddRNAi были доставлены интратекально с использованием лентивирусного вектора, было продемонстрировано облегчение боли на модели нейропатической крысы.[6]

Лекарственно-устойчивый немелкоклеточный рак легкого

Развитие устойчивости к химиотерапии, такой как паклитаксел и цисплатин в немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) тесно связан с избыточной экспрессией бета III тубулин. Исследования Детского онкологического института Австралии (Университет Нового Южного Уэльса, Центр исследования рака Лоуи ) продемонстрировали, что нокдаун бета III-тубулина ddRNAi задерживает рост опухоли и увеличивает химиочувствительность на моделях мышей.[5]

Трибутарна представляет собой тройную кассету ДНК, экспрессирующую три молекулы shРНК, каждая из которых по отдельности нацелена на тубулин бета III и сильно ингибирует его экспрессию. Исследования на модели ортотопической мыши, где конструкция доставляется модифицированным полиэтиленимин вектор, jetPEI, который нацелен на легочную ткань.

Вирусная инфекция гепатита В

Геном вируса гепатита B (HBV) кодирует собственный ДНК-полимераза для тиражирования. Biomics Biotechnologies провела оценку около 5000 последовательностей siRNA этого гена на предмет эффективного нокдауна; пять последовательностей были выбраны для дальнейшего исследования, и было показано, что они обладают мощной активностью по подавлению звука при преобразовании в кассеты экспрессии shRNA. Мультикассетная конструкция Hepbarna находится в стадии доклинической разработки для доставки специалистом. аденоассоциированный вирус 8 (AAV-8) вектор, нацеленный на печень.

Окулофарингеальная мышечная дистрофия

Классифицируется как сиротская болезнь, в настоящее время не существует терапии OPMD, вызванной мутацией в ядерном 1 связывающем поли (A) белке (PABPN1 ) ген. Молчание мутантного гена с помощью ddRNAi предлагает потенциальный терапевтический подход.[11]

ВИЧ / СПИД

Помимо подхода ex vivo Национальный медицинский центр "Город надежды" Как обсуждалось выше, Амстердамский центр инфекций и иммунитета (CINIMA) при Амстердамском университете, Нидерланды, активно изучает состав многокассетных ДНК-конструкций для борьбы с ВИЧ.[12]

Соображения безопасности

Как и все генная терапия, при разработке терапевтических средств ddRNAi необходимо оценить ряд вопросов безопасности и токсичности:

Активация онкогена путем вставки вируса: некоторые векторы генной терапии интегрируются в геном хозяина, тем самым действуя как инсерционные мутагены. Это была особая проблема с ранними ретровирусными векторами, где вставки, прилегающие к онкогены привело к развитию лимфоидных опухолей.[13] Векторы AAV считаются малым риском интеграции генома хозяина, поскольку аденоассоциированный вирус инфекция не была связана с индукцией рака у людей, несмотря на широкую распространенность среди населения в целом. Более того, широкое клиническое использование векторов AAV не дало доказательств канцерогенности. Хотя лентивирусные векторы действительно интегрируются в геном, они, по-видимому, не проявляют склонности к активации экспрессии онкогенов.[14]

Иммунный ответ на векторы генной терапии: иммунологический ответ на аденовирусный вектор привел к смерти пациента в раннем испытании на людях. Тщательный мониторинг потенциальной токсичности в ходе доклинических испытаний и анализов уже существующих антител к векторам генной терапии у пациентов сводит к минимуму такие риски.

Врожденный иммунный ответ: было показано, что siRNA активируют иммунные ответы посредством взаимодействия с Toll-подобными рецепторами, что приводит к ответам интерферона. Эти рецепторы располагаются на поверхности клеток, поэтому не ожидается, что конструкции ddRNAi, доставленные непосредственно во внутриклеточное пространство, будут вызывать этот ответ.[15]

Токсические эффекты из-за чрезмерной экспрессии shРНК: было показано, что высокий уровень экспрессии shRNA является токсичным. Стратегии минимизации уровней экспрессии shRNA[4] или способствовать точной обработке shRNAs[16] может преодолеть эту проблему.

Нецелевые эффекты: теоретически может произойти непреднамеренное подавление генов, которые имеют гомологию последовательностей с экспрессируемыми shРНК.[17] Тщательный отбор последовательностей shRNA и тщательное доклиническое тестирование конструкций позволяют обойти эту проблему.

дальнейшее чтение

  • Rice, R. R .; Muirhead, A.N .; Harrison, B.T .; Kassianos, A.J .; Sedlak, P. L .; Maugeri, N.J .; Госс, П. Дж .; Davey, J. R .; Джеймс, Д. Э .; Грэм, М. В. (2005). Простые и надежные стратегии создания ДНК-направленных конструкций интерференции РНК. Методы в энзимологии. 392. С. 405–419. Дои:10.1016 / S0076-6879 (04) 92024-1. ISBN  9780121827977. PMID  15644195.
  • Liu, Y. P .; Westerink, J. T .; Тормоз, О .; Беркхоут, Б. (2011). «РНКи-индуцирующие лентивирусные векторы для генной терапии против ВИЧ-1». Противовирусные РНКи. Методы молекулярной биологии. 721. С. 293–311. Дои:10.1007/978-1-61779-037-9_18. ISBN  978-1-61779-036-2. PMID  21431693.

Рекомендации

  1. ^ а б Lambeth, L. S .; Смит, К. А. (2013). "Короткая шпилька РНК-опосредованное молчание гена". SiRNA Дизайн. Методы молекулярной биологии. 942. С. 205–232. Дои:10.1007/978-1-62703-119-6_12. ISBN  978-1-62703-118-9. PMID  23027054.
  2. ^ а б c d е Digiusto, D. L .; Кришнан, А .; Li, L .; Li, H .; Li, S .; Rao, A .; Mi, S .; Yam, P .; Стинсон, С .; Kalos, M .; Alvarnas, J .; Лейси, С. Ф .; Yee, J. -K .; Li, M .; Couture, L .; Hsu, D .; Forman, S.J .; Росси, Дж. Дж .; Зайя, Дж. А. (2010). «РНК-основанная генная терапия ВИЧ с использованием модифицированных лентивирусным вектором клеток CD34 + у пациентов, перенесших трансплантацию лимфомы, связанной со СПИДом». Научная трансляционная медицина. 2 (36): 36ra43. Дои:10.1126 / scitranslmed.3000931. ЧВК  3130552. PMID  20555022.
  3. ^ а б Chen, C. -C .; Chang, C. -M .; Sun, C. -P .; Yu, C. -P .; Wu, P. -Y .; Jeng, K. -S .; Hu, C. -P .; Chen, P. -J .; Wu, J. -C .; Shih, C.H .; Гершвин, М. Э .; Тао, М. -H. (2011). «Использование РНК-интерференции для модуляции развития аденомы печени на мышиной модели, трансгенной по вирусу гепатита B». Генная терапия. 19 (1): 25–33. Дои:10.1038 / gt.2011.60. PMID  21562593.
  4. ^ а б c d е ж Сухи, Д. А .; Kao, S.C .; Mao, T .; Whiteley, L .; Дениз, H .; Souberbielle, B .; Burdick, A.D .; Hayes, K .; Wright, J. F .; Lavender, H .; Roelvink, P .; Колыхалов, А .; Brady, K .; Moschos, S.A .; Hauck, B .; Зеленая, О .; Чжоу, S .; Scribner, C .; High, K. A .; Renison, S. H .; Корбау Р. (2012). «Безопасная, долговременная печеночная экспрессия кшРНК против HCV на нечеловеческой модели приматов». Молекулярная терапия. 20 (9): 1737–1749. Дои:10,1038 / мт.2012.119. ЧВК  3437581. PMID  22735378.
  5. ^ а б McCarroll, J. A .; Gan, P. P .; Лю, М .; Кавалларис, М. (2010). «III-Тубулин - это многофункциональный белок, участвующий в чувствительности к лекарственным препаратам и опухолевом генезе немелкоклеточного рака легкого». Исследования рака. 70 (12): 4995–5003. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-09-4487. PMID  20501838.
  6. ^ а б c d Zou, W .; Песня, З .; Guo, Q .; Liu, C .; Zhang, Z .; Чжан, Ю. (2011). «Интратекально опосредованная лентивирусами РНК-интерференция, направленная на PKCγ, ослабляет нейропатическую боль, вызванную хронической суженной травмой у крыс». Генная терапия человека. 22 (4): 465–475. Дои:10.1089 / hum.2010.207. PMID  21087146.
  7. ^ а б Senzer, N .; Barve, M .; Kuhn, J .; Мельник, А .; Beitsch, P .; Лазарь, М .; Лифшиц, С .; Magee, M .; О, Дж .; Mill, S.W .; Bedell, C .; Higgs, C .; Kumar, P .; Yu, Y .; Norvell, F .; Phalon, C .; Taquet, N .; Rao, D. D .; Wang, Z .; Jay, C.M .; Pappen, B.O .; Wallraven, G .; Brunicardi, F.C .; Shanahan, D. M .; Maples, P. B .; Немунайтис, Дж. (2011). «Фаза I испытания вакцины би-shРНКифурин / ДНК GMCSF / аутологичных опухолевых клеток (FANG) при запущенном раке». Молекулярная терапия. 20 (3): 679–686. Дои:10.1038 / мт.2011.269. ЧВК  3293620. PMID  22186789.
  8. ^ а б Millington-Ward, S .; Chadderton, N .; О'Рейли, М .; Palfi, A .; Goldmann, T .; Килти, К .; Humphries, M .; Wolfrum, U .; Bennett, J .; Humphries, P .; Kenna, P. F .; Фаррар, Дж. Дж. (2011). «Подавление и заместительная генная терапия аутосомно-доминантного заболевания на мышиной модели доминантного пигментного ретинита». Молекулярная терапия. 19 (4): 642–649. Дои:10.1038 / мт.2010.293. ЧВК  3070095. PMID  21224835.
  9. ^ Gu, S .; Jin, L .; Zhang, Y .; Huang, Y .; Zhang, F .; Вальдманис, П. Н .; Кей, М.А. (2012). «Положение петли shRNA и пре-miRNA имеет решающее значение для точности обработки дайсером in vivo». Клетка. 151 (4): 900–911. Дои:10.1016 / j.cell.2012.09.042. ЧВК  3499986. PMID  23141545.
  10. ^ Ringpis, G.E.E .; Shimizu, S .; Arokium, H .; Camba-Colón, J .; Кэрролл, М. В .; Cortado, R .; Xie, Y .; Kim, P. Y .; Саакян А .; Lowe, E. L .; Нарукава, М .; Кандарян, Ф. Н .; Burke, B.P .; Symonds, G.P .; An, D. S .; Chen, I. S .; Камата, М. (2012). Спек, Роберто Ф (ред.). «Конструирование устойчивых к ВИЧ-1 Т-клеток из короткошпилочных РНК-экспрессирующих гемопоэтических стволовых / клеток-предшественников у гуманизированных мышей BLT». PLOS ONE. 7 (12): e53492. Bibcode:2012PLoSO ... 753492R. Дои:10.1371 / journal.pone.0053492. ЧВК  3534037. PMID  23300932.
  11. ^ Троллет, Ц .; Anvar, S. Y .; Венема, А .; Hargreaves, I.P .; Фостер, К .; Vignaud, A .; Ферри, А .; Negroni, E .; Hourde, C .; Baraibar, M.A .; "t" hoen, P.A.C .; Davies, J. E .; Рубинштейн, Д. С .; Heales, S.J .; Мулы, В .; Van Der Maarel, S.M .; Батлер-Браун, G .; Раз, В .; Диксон, Г. (2010). «Молекулярная и фенотипическая характеристика мышиной модели окулофарингеальной мышечной дистрофии выявляет тяжелую мышечную атрофию, ограниченную быстрыми гликолитическими волокнами». Молекулярная генетика человека. 19 (11): 2191–2207. Дои:10.1093 / hmg / ddq098. PMID  20207626.
  12. ^ Тормоз, О. Т .; Хоофт, К. 'Т .; Liu, Y. P .; Centlivre, M .; Jasmijn Von Eije, K .; Беркхоут, Б. (2008). «Дизайн лентивирусного вектора для множественной экспрессии shРНК и стойкого ингибирования ВИЧ-1». Молекулярная терапия. 16 (3): 557–564. Дои:10.1038 / sj.mt.6300382. PMID  18180777.
  13. ^ Woods, N.B .; Боттеро, В .; Schmidt, M .; Von Kalle, C .; Верма, И. М. (2006). «Генная терапия: терапевтический ген, вызывающий лимфому». Природа. 440 (7088): 1123. Bibcode:2006 Натур.440.1123W. Дои:10.1038 / 4401123a. PMID  16641981. S2CID  4372110.
  14. ^ Wang, G.P .; Levine, B.L .; Binder, G.K .; Berry, C.C .; Malani, N .; McGarrity, G .; Тебас, П .; June, C. H .; Бушман, Ф. Д. (2009). «Анализ интеграции лентивирусного вектора в ВИЧ + исследуемых субъектов, получающих аутологичные инфузии генетически модифицированных CD4 + Т-клеток». Молекулярная терапия. 17 (5): 844–850. Дои:10.1038 / мт.2009.16. ЧВК  2835137. PMID  19259065.
  15. ^ Kleinman, M.E .; Yamada, K .; Takeda, A .; Чандрасекаран, V .; Нодзаки, М .; Baffi, J. Z .; Albuquerque, R.J.C .; Yamasaki, S .; Itaya, M .; Pan, Y .; Appukuttan, B .; Gibbs, D .; Ян, З .; Карико, К .; Ambati, B.K .; Wilgus, T. A .; Дипьетро, ​​Л. А .; Sakurai, E .; Zhang, K .; Smith, J. R .; Тейлор, Э. У .; Амбати, Дж. (2008). «Последовательность и независимое от мишени подавление ангиогенеза с помощью миРНК через TLR3». Природа. 452 (7187): 591–597. Bibcode:2008Натура.452..591K. Дои:10.1038 / природа06765. ЧВК  2642938. PMID  18368052.
  16. ^ McBride, J. L .; Boudreau, R.L .; Harper, S. Q .; Staber, P.D .; Monteys, A.M .; Мартинс, И .; Gilmore, B.L .; Burstein, H .; Peluso, R.W .; Полиски, Б .; Картер, Б. Дж .; Дэвидсон, Б. Л. (2008). «Искусственные miRNAs уменьшают shRNA-опосредованную токсичность в головном мозге: значение для терапевтического развития RNAi». Труды Национальной академии наук. 105 (15): 5868–5873. Bibcode:2008ПНАС..105.5868М. Дои:10.1073 / pnas.0801775105. ЧВК  2311380. PMID  18398004.
  17. ^ Джексон, А. Л .; Bartz, S. R .; Schelter, J .; Кобаяси, С. В .; Burchard, J .; Mao, M .; Li, B .; Cavet, G .; Линсли, П. С. (2003). «Профили экспрессии выявляют регуляцию нецелевого гена с помощью РНКи». Природа Биотехнологии. 21 (6): 635–637. Дои:10.1038 / nbt831. PMID  12754523. S2CID  24778534.