Эластиноподобные полипептиды - Elastin-like polypeptides

Изображенная выше мономерная единица ELP, в которой остаток X представляет собой треонин. Из этого мономерного звена будет создан полимер ELP.

Эластиноподобные полипептиды (ELP) синтезированы биополимеры которые стали предметом интереса из-за их потенциально практической пользы. Они могут иметь ключевые приложения в областях рак терапия, ткань строительные леса, и белок очищение. Что касается лечения рака, исследования показали, что манипуляции с ELP посредством добавления функциональных групп могут позволить ELP конъюгировать с цитотоксическими лекарствами.[1] Кроме того, ELP могут действовать как полимерные каркасы, которые способствуют регенерации тканей. Эта способность ELP изучалась, в частности, в контексте роста костей.[2] ELP могут быть созданы для распознавания определенных белков в растворе. Аспект очистки белков ELP подтверждается способностью этих полимеров претерпевать морфологические изменения при определенных температурах, что позволяет отделить ELP, связанные с конкретными белками, от остальной части раствора с помощью экспериментальных методов, таких как центрифугирование.[3]

Общая структура полимерных ELP (VPGXG)п, где мономерное звено Вал -Pro -Gly -ИКС-Gly, а «X» обозначает вариабельную аминокислоту, которая может влиять на общие свойства ELP, такие как температура перехода (Tт). В частности, гидрофильность или гидрофобность, а также наличие или отсутствие заряда на гостевом остатке играют большую роль в определении Tт. Кроме того, солюбилизация гостевого остатка может влиять на Tт. «N» обозначает количество мономерных единиц, которые составляют полимер.[4][5][6][7] Как правило, эти полимеры линейны ниже Tт, но собираются в сферические сгустки выше Tт..[3]

Структура

Несмотря на то, что ELP были разработаны и модифицированы в лабораторных условиях, они имеют общие структурные характеристики с внутренне неупорядоченными белками (IDP), которые естественным образом встречаются в организме, например тропоэластин, откуда и было дано название ELP. Повторяющиеся последовательности, обнаруженные в биополимере, придают каждому ELP отличную структуру, а также влияют на более низкую критическую температуру раствора (LCST), также обычно называемую Tт. Именно при этой температуре ELP переходят из линейного, относительно неупорядоченного состояния в более плотно агрегированное, частично упорядоченное состояние. [7] Хотя задано как единственная температура, Tт, процесс изменения фазы ELP обычно начинается и заканчивается в диапазоне температур приблизительно 2 ° C. Также, Tт изменяется путем добавления уникальных белков к свободным ELP.[5]

Тропоэластин

Это изображение отображает механизм, с помощью которого остатки лизина на тропоэластине сшиваются вместе. Сначала происходит преобразование некоторых остатков лизина в аллизин, а затем происходит связывание лизина и аллизина. Это позволяет эластину формироваться во внеклеточном матриксе.

Тропоэластин представляет собой белок размером 72 кДа, который соединяется через поперечные связи с образованием эластин во внеклеточном матриксе клетки. Процесс образования поперечных связей опосредуется лизилоксидазой.[8] Одна из основных причин, по которой эластин может выдерживать высокие уровни стресса в организме без каких-либо физических деформаций, заключается в том, что лежащий в основе тропоэластин содержит домены, которые являются высокогидрофобными. Эти гидрофобные домены, состоящие преимущественно из аланина, пролина, глицина и валина, имеют тенденцию к нестабильности и беспорядку, гарантируя, что эластин не фиксируется каким-либо конкретным подтверждением. Таким образом, ELP, состоящие из Вал -Pro -Gly -ИКС-Gly мономерные единицы, которые имеют сходство с повторяющимися гидрофобными доменами тропоэластина, сильно разупорядочены ниже их Tт. Даже выше их Tт в своем агрегированном состоянии ELP упорядочены только частично. Это связано с тем, что аминокислоты пролина и глицина присутствуют в больших количествах в ELP. Глицин из-за отсутствия объемной боковой цепи позволяет биополимеру быть гибким, а пролин предотвращает образование стабильных водородных связей в основной цепи ELP. Однако важно отметить, что определенные сегменты ELP могут быть способны образовывать мгновенные β-витки типа II, но эти витки непродолжительны и не похожи на настоящие β-листы, когда сравниваются химические сдвиги ЯМР.[7]

Это видео демонстрирует сборку единиц тропоэластина с образованием эластина.

Образование амилоида

Хотя ELP обычно образуют обратимые сферические агрегаты из-за содержания в них пролина и глицина, существует вероятность того, что при определенных условиях, таких как чрезвычайно высокие температуры, ELP будут образовывать амилоиды, или необратимые агрегаты нерастворимого белка. Также считается, что изменения в основной цепи ELP, ведущие к снижению содержания пролина и глицина, могут приводить к ELP с большей склонностью к амилоидному состоянию. Поскольку амилоиды участвуют в прогрессировании Болезнь Альцгеймера а также при прионных заболеваниях, таких как болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD) моделирование образования амилоида ELP может быть полезно с биомедицинской точки зрения.[7]

Тт зависимость от структуры ELP

Температура перехода ELP зависит до определенной степени от идентичности остатка «X», находящегося в четвертом положении мономерной единицы пентапептида. Остатки с высокой гидрофобностью, такие как лейцин и фенилаланин, имеют тенденцию к снижению температуры перехода. С другой стороны, высокогидрофильные остатки, такие как серин и глутамин, имеют тенденцию к увеличению температуры перехода. Присутствие потенциально заряженного остатка в положении «X» будет определять, как ELP реагирует на изменение pH, с глютаминовая кислота и аспарагиновая кислота повышение Tт при значениях pH, при которых остатки депротонированы и лизин и аргинин повышение Tт при значениях pH, при которых остатки протонированы. Уровень pH должен быть совместим с заряженными состояниями этих аминокислот, чтобы поднять Tт. Кроме того, ELP с более высокой молекулярной массой и более высокие концентрации ELP в растворе значительно упрощают формирование агрегатов полимером, в результате чего экспериментальное Tт. [9]

Тт теоретическая модель

Часто ELP не используются изолированно, а скорее сливаются с другими белками, чтобы стать функционально активными. Структура этих других белков будет иметь определенное влияние на температуру перехода. Важно иметь возможность предсказать температуру перехода, которую эти слитые белки будут иметь относительно свободных ELP, поскольку эта температура будет определять применимость слитого белка и фазовый переход. Имеется теоретическая модель, связывающая изменение Tт слитого белка с различными соотношениями каждой отдельной аминокислоты, обнаруженной в слитом белке. Модель включает в себя вычисление индекса поверхности (SI), связанного с каждой аминокислотой, а затем экстраполяцию на основе соотношения каждой аминокислоты, присутствующей в слитом белке, общего изменения Tт связанный с гибридным белком, ΔTт, фьюжн:[10]

SI =(КАКXAA/ КАКп) (Тtc) [10]

где ASAп относится к площади всего слитого белка, доступной для используемого растворителя, ASAXAA относится к области гостевого остатка на ELP, доступной для растворителя, а Ttc - это температура перехода, уникальная для аминокислоты. Суммирование вклада каждого потенциального гостевого остатка (XAA) даст индекс SI, который прямо пропорционален ΔT.т, фьюжн. Было обнаружено, что аминокислоты, заряженные при физиологическом pH 7,4, оказывают наибольшее влияние на общий SI слитого белка. Это связано с тем, что они более доступны для водосодержащих растворителей, тем самым увеличивая ASA.XAA а также имеют высокий Ttc значения. Следовательно, знание температуры перехода слитого белка сильно зависит от присутствия этих заряженных остатков.[10]

Синтез

Поскольку ELP представляют собой биополимеры на основе белков, синтез включает манипуляции с генами для постоянной экспрессии мономерной повторяющейся единицы. Для получения ELP различных размеров применялись различные методы, включая однонаправленное лигирование или конкатемеризацию, полимеразную цепную реакцию с удлинением путем перекрывания (OEPCR) и рекурсивное направленное лигирование (RDL).[5][9] Кроме того, ELP можно экспериментально модифицировать путем конъюгации с другими полимерами или посредством SpyTag / SpyCatcher реакция[11] позволяющий синтезировать сополимеры с уникальной морфологией.[12]

Конкатемеризация

В процессе конкатемеризации создаются библиотеки конкатамеры для ELP. Конкатамеры представляют собой олигомерные продукты лигирования одного гена с самим собой. Это приведет к появлению повторяющихся сегментов гена, каждый из которых может быть немедленно транскрибирован и транслирован для получения интересующего ELP. Основная проблема этого синтетического пути заключается в том, что количество сегментов генных повторов, связанных вместе с образованием конкатамера, невозможно контролировать, что приводит к образованию ELP различных размеров, из которых необходимо изолировать ELP желаемого размера.[9]

Полимеразная цепная реакция с удлинением перекрытия (OEPCR)

Метод OEPCR использует небольшое количество гена, кодирующего мономерную единицу ELP, и приводит к значительной амплификации этого сегмента. Эта амплификация связана с тем, что начальный сегмент, добавленный в реакцию, действует как матрица, из которой могут быть синтезированы идентичные генные сегменты. В результате будет получена двухцепочечная ДНК, кодирующая интересующий ELP. Одним из основных узких мест, связанных с этим методом, является потенциально низкая точность, связанная с Полимераза Taq использовал. Это может привести к репликации из матрицы, в которой неправильные нуклеотиды включены в растущую цепь ДНК.[9]

Рекурсивная направленная перевязка (RDL)

При рекурсивном направленном лигировании ген, кодирующий мономер, вставляется в плазмида с сайтами рестрикции, которые распознаются как минимум двумя эндонуклеазы. Эндонуклеазы разрезают плазмиду, высвобождая интересующий ген. Затем этот единственный ген вставляют в вектор плазмиды-реципиента, уже содержащий одну копию гена мономера ELP, посредством расщепления плазмиды-реципиента теми же эндонуклеазами рестрикции, которые используются в донорской плазмиде, и последующей стадии лигирования. В результате этого процесса извлекается последовательность из двух мономерных генов ELP. RDL позволяет осуществлять контролируемый синтез олигомеров гена ELP, в который последовательно добавляются отдельные генные сегменты. Однако используемые эндонуклеазы рестрикции ограничиваются теми, которые не разрезают сам ген мономера ELP, так как это может привести к потере критических нуклеотидов и потенциальной мутации сдвига рамки считывания в белке.[5]

Синтетическое сопряжение

Было показано, что ELP могут быть синтетически конъюгированы с поли (этиленгликоль ). Чтобы выполнить эту конъюгацию, функциональный мотив циклооктина добавляется к поли (этиленгликолю), а азидная группа добавляется к ELP. Посредством реакции циклоприсоединения с участием обеих функциональных групп и изменения pH растворителя могут быть образованы диблочные и звездообразные полимеры. Вместо того, чтобы формировать канонические сферические сгустки выше температуры перехода, этот специфический конъюгированный ELP образует мицеллу с амфифильный свойства, в которых полярные головные группы обращены наружу, а гидрофобные домены обращены внутрь. Такие мицеллы могут быть особенно полезны при доставке неполярных лекарств в организм.[12]

Приложения

Из-за уникального температурно-зависимого фазового перехода, который испытывают ELP, когда они переходят из линейного состояния в сферическое агрегатное состояние выше их Tт, а также способность ELP легко конъюгировать с другими соединениями, эти биополимеры находят множество применений. Некоторые из этих приложений включают использование ELP для очистки белка, терапии рака и создания тканевых каркасов.[1][2][3]

Очистка белков

ELP можно конъюгировать с функциональной группой, которая может связываться с представляющим интерес белком. При температурах ниже Tт, ELP будет связываться с лигандом в своей линейной форме. В этом линейном состоянии комплекс ELP-белок нельзя легко отличить от посторонних белков в растворе. Однако, как только раствор нагревается до температуры, превышающей Tт, ELP будет образовывать сферические сгустки. Эти комки затем оседают на дно пробирки с раствором после центрифугирования, неся интересующий белок. Ненужные белки будут обнаружены в супернатанте, который можно физически отделить от сферических агрегатов. Чтобы гарантировать, что в изолированном комплексе ELP-белок мало примесей, раствор можно охладить до температуры ниже Tт, позволяя ELP снова принять свою линейную структуру. С этого момента циклы горячего и холодного центрифугирования могут быть повторены, а затем интересующий белок может быть элюирован из ELP посредством добавления соли.[3]

На этой диаграмме показано, как можно выделить белки с помощью технологии ELP. При температурах ниже температуры перехода ELP остается в своем линейном состоянии, но связывается с интересующим белком через функциональную группу. Когда раствор нагревается выше температуры перехода, ELP начинает образовывать сферические сгустки, которые будут агрегироваться на дне пробирки после центрифугирования. ELP будет содержать интересующий белок (синий) и отделять его от посторонних белков (фиолетовый).

Тканевые леса

Фазовое поведение ELP на основе температуры может использоваться для создания жестких сетей, которые могут быть совместимы с приложениями регенерации сотовой связи. При высоких концентрациях (массовые проценты, превышающие 15%), переход ELP из линейного состояния в сферическое агрегатное состояние выше температуры перехода прекращается, что приводит к образованию хрупких гелей. Эти в противном случае хрупкие сети могут быть затем химически модифицированы посредством окислительного связывания, чтобы получить гидрогели, которые могут выдерживать высокие уровни механического напряжения и деформации. Кроме того, модифицированные гелевые сети содержат поры, через которые могут быть легко доставлены важные поддерживающие клетки соединения. Было обнаружено, что такие сильные гидрогели, погруженные в минимальную клеточную среду, способствуют росту человека. мезенцихмальный популяции стволовых клеток. Способность этих заблокированных сетей ELP стимулировать рост клеток может оказаться необходимой, например, при производстве тканевых каркасов, которые способствуют образованию хряща. Такое вмешательство может оказаться полезным при лечении заболеваний костей и ревматоидный артрит.[2]

Лечение рака

ELP, модифицированные определенными функциональными группами, обладают способностью конъюгироваться с химиотерапевтическими агентами. Вместе комплекс ELP-лекарственное средство может в большей степени поглощаться опухолевыми клетками, способствуя цитотоксической активности лекарственного средства. Причина того, что комплексы преимущественно нацелены на опухолевые клетки, заключается в том, что эти клетки имеют тенденцию быть связаны с более проницаемыми кровеносными сосудами, а также обладают более слабым лимфатическим присутствием. По сути, это означает, что лекарственные препараты могут чаще переходить из сосудов в опухолевые клетки и могут оставаться в сосудах в течение более длительного периода времени без фильтрации. Фазовый переход, связанный с ELP, также может быть использован для стимулирования поглощения лекарства опухолевыми клетками. При локальном нагревании областей опухолевых клеток комплекс ELP-лекарственное средство будет агрегироваться в сферические скопления. Если этот комплекс ELP-лекарственное средство сконструирован так, чтобы экспонировать функциональные домены в форме сферического комка, которые распознаются поверхностями опухолевых клеток, то это взаимодействие на поверхности клеток будет способствовать поглощению лекарственного средства, поскольку опухолевая клетка будет ошибочно принимать комплекс ELP-лекарственное средство за безвредное вещество.[1][9]

Выше показан химиотерапевтический агент доксорубицин, конъюгированный с ELP.

Рекомендации

  1. ^ а б c Saxena, R; Нанджан, MJ (2013). «Эластиноподобные полипептиды и их применение в системах доставки противораковых лекарств: обзор». Доставки лекарств. 22 (2): 156–167. Дои:10.3109/10717544.2013.853210.
  2. ^ а б c Глассман, MJ; Эйвери, РК; Хадемхоссейни, А; Ольсен, Б.Д. (2016). «Упрочнение термореактивных арестованных сетей эластиноподобных полипептидов для разработки цито-совместимых тканевых каркасов». Биомакромолекулы. 17 (2): 415–426. Дои:10.1021 / acs.biomac.5b01210. HDL:1721.1/109600.
  3. ^ а б c d Hassouneh, W; Кристенсен, Т; Чилкоти, А (2010). «Эластиноподобные полипептиды как метка очистки рекомбинантных белков». Текущие протоколы в науке о белке. Глава 6 (1): Раздел 6.11. Дои:10.1002 / 0471140864.ps0611s61. ЧВК  3076942. PMID  20814933.
  4. ^ Кристенсен, Т; Hassouneh, W; Траббик-Карлсон, К; Чилкоти, А (2013). «Прогнозирование температур перехода эластиноподобных полипептидных слитых белков». Биомакромолекулы. 14 (5): 1514–1519. Дои:10.1021 / bm400167h. ЧВК  3667497. PMID  23565607.
  5. ^ а б c d Ковальчик, Т; Гнатушко-Конка, К; Герсберг, А; Кононович, АК (2014). «Эластиноподобные полипептиды как многообещающее семейство генно-инженерных полимеров на основе белков». World J Microbiology Biotechnology. 30 (8): 2141–2152. Дои:10.1007 / s11274-014-1649-5. ЧВК  4072924. PMID  24699809.
  6. ^ Валяев А; Lim, DW; Шмидлер, S; Кларк, Р.Л .; и другие. (2008). «Гидратация и конформационная механика единичных эластиноподобных полипептидов с концевыми связями». Журнал Американского химического общества. 130 (33): 10939–10946. Дои:10.1021 / ja800502h. ЧВК  2736882. PMID  18646848.
  7. ^ а б c d Робертс, S; Дзурицкий, М; Чилкоти, А (2015). «Эластиноподобные полипептиды как модели внутренне неупорядоченных белков». Письма FEBS. 589 (19): 2477–2486. Дои:10.1016 / j.febslet.2015.08.029.
  8. ^ Floss, DM; Schallau, K; Роуз-Джон, S; Конрад, U; Шеллер, Дж (2010). «Эластиноподобные полипептиды революционизируют экспрессию рекомбинантных белков и их биомедицинское применение». Тенденции в биотехнологии. 28 (1): 37–45. Дои:10.1016 / j.tibtech.2009.10.004.
  9. ^ а б c d е Йео, GC; Агаеи-Гарех-Болаг, Б; Brackenreg, EP; Hiob, Массачусетс; Ли, П; Weiss, AS. (Март 2015 г.). «Изготовленный эластин». Передовые медицинские материалы. 4 (16): 2530-2556. Дата обращения 15 мая 2017.
  10. ^ а б c Кристенсен, Т; Hassouneh, W; Trabbic-Carlson, K .; Чилкоти, А. (2013). «Прогнозирование температур перехода эластиноподобных белков слияния полипептидов». Биомакромолекулы. 14 (5): 1514–1519. Дои:10.1021 / bm400167h. ЧВК  3667497. PMID  23565607.
  11. ^ Вс, пт; Чжан, ВБ; Махдави, А; Арнольд, FH; Тиррелл, Д. (2014). «Синтез биоактивных белковых гидрогелей с помощью генетически закодированной химии SpyTag-SpyCatcher». PNAS. 111 (31): 11269–11274. Bibcode:2014ПНАС..11111269С. Дои:10.1073 / pnas.1401291111. ЧВК  4128157. PMID  25049400.
  12. ^ а б Элдейк, МБ; Смитс, FCM; Vermue, N; Дебец, МФ; Schoffele, S; Хест, JCM (2014). «Синтез и самосборка четко определенных эластиноподобных конъюгатов полипептид-поли (этиленгликоль)». Биомакромолекулы. 15: 2751–2759. Дои:10.1021 / bm5006195.