Генотипирование путем секвенирования - Genotyping by sequencing

В области генетическое секвенирование, генотипирование путем секвенирования, также называемый GBS, это метод обнаружения однонуклеотидный полиморфизм (SNP) для выполнения генотипирование исследования, такие как исследования ассоциации всего генома (GWAS ).^[1] GBS использует рестрикционные ферменты для уменьшения сложности генома и генотипирования нескольких образцов ДНК.^[2] После переваривания ПЦР выполняется для увеличения пула фрагментов, а затем библиотеки GBS секвенируются с использованием технологий секвенирования следующего поколения, что обычно приводит к чтению с одного конца около 100 пар оснований.^[3] Он относительно недорогой и использовался в селекция растений.^[2] Хотя GBS представляет подход, похожий на секвенирование ДНК, связанное с сайтами рестрикции (RAD-seq), они существенно различаются.^[4]

Методы

GBS - это надежная, простая и доступная процедура для обнаружения и сопоставления SNP. В целом, этот подход снижает сложность генома с помощью рестрикционных ферментов (RE) у разнообразных видов с большим количеством геномов для эффективного высокопроизводительного и высоко мультиплексированного секвенирования. Используя соответствующие RE, можно избежать повторяющихся областей геномов и нацелить области с более низкой копией, что снижает проблемы выравнивания у генетически очень разнообразных видов. Метод был впервые описан Elshire et al. (2011).^[1] Таким образом, высокий молекулярный вес ДНК извлекаются и перевариваются с использованием определенного RE, ранее определенного путем частого разрезания.^[5] в основной повторяющейся части генома. ApeKI является наиболее часто используемым RE. Затем адаптеры штрих-кода прикрепляются к липкие концы и ПЦР-амплификация выполняется. Выполняется технология секвенирования следующего поколения, в результате чего односторонние считывания составляют около 100 пар оснований. Необработанные данные последовательности фильтруются и выравниваются по эталонному геному с использованием обычно Берроуз-Уиллер инструмент для центровки (BWA) или Галстук-бабочка 2. Следующим шагом является определение SNP из выровненных тегов и оценка всех обнаруженных SNP для различного охвата, глубины и генотипической статистики. После того, как будет запущено крупномасштабное производство SNP для всего вида, можно быстро вызвать известные SNP во вновь секвенированных образцах.^[6]

Первоначально подход GBS был протестирован и подтвержден на рекомбинантных инбредных линиях (RIL) из популяции картирования кукурузы с высоким разрешением (IBM) и линий ячменя с удвоенными гаплоидами (DH) из популяции картирования ячменя Вулфа Орегона (OWB). До 96 образцов ДНК, расщепленных RE (ApeKI), объединяли и обрабатывали одновременно во время создания библиотеки GBS, которую проверяли на анализаторе генома II (Illumina, Inc.). В целом, 25 185 двуаллельных меток было нанесено на карту кукурузы, а 24 186 меток последовательности - ячменя. Проверка маркеров GBS ячменя с использованием одной линии DH (OWB003) показала 99% совпадение между контрольными маркерами и нанесенными на карту показаниями GBS. Хотя у ячменя отсутствует полная последовательность генома, GBS не требует эталонного генома для картирования тегов последовательности, эталон разрабатывается в процессе выборочного генотипирования. Теги также можно рассматривать как доминантные маркеры для альтернативного генетического анализа в отсутствие эталонного генома. Помимо мультиплексного скимминга GBS, вменение отсутствующих SNP может еще больше снизить затраты на GBS. GBS - это универсальная и рентабельная процедура, которая позволит добывать геномы любого вида без предварительного знания структуры его генома. ^[1]

Рекомендации