Липкие и тупые концы - Sticky and blunt ends

Концы ДНК относятся к свойствам конца ДНК молекулы, которые могут быть липкими или тупыми в зависимости от фермента, разрезающего ДНК. Рестрикционные ферменты относятся к более широкому классу ферментов, называемых экзонуклеазы и эндонуклеазы. Экзонуклеазы удаляют нуклеотид с концов, тогда как эндонуклеаза разрезает в определенном положении в ДНК.

Концепция используется в молекулярная биология, особенно в клонирование или при субклонировании ДНК вставляется в вектор ДНК. Такие цели могут быть достигнуты рестрикционные ферменты которые разрезают ДНК - ступенчатый разрез дает два липких конца, а прямой разрез приводит к тупым концам.^[1]

Одноцепочечные молекулы ДНК

Одноцепочечная некруглая молекула ДНК имеет два неидентичных конца, 3 'конец и 5' конец (обычно произносится как «три простых конца» и «пять простых концов»). Цифры относятся к нумерации атомов углерода в дезоксирибоза, который представляет собой сахар, составляющий важную часть основы молекулы ДНК. В основной цепи ДНК 5'-углерод одной дезоксирибозы связан с 3'-углеродным атомом другой фосфодиэфирной связью. 5'-углерод этой дезоксирибозы снова связан с 3'-углеродным атомом следующего, и так далее.

Вариации в двухцепочечных молекулах

Когда молекула ДНК двухцепочечная, как это обычно бывает, две цепи идут в противоположных направлениях. Следовательно, один конец молекулы будет иметь 3'-конец цепи 1 и 5'-конец цепи 2, и наоборот, на другом конце. Однако тот факт, что молекула двухцепочечная, допускает множество различных вариаций.

Тупые концы

Самый простой конец ДНК двухцепочечной молекулы называется тупой конец. Тупые концы также известны как несвязные концы. В молекуле с тупым концом обе цепи оканчиваются базовая пара. Тупые концы не всегда желательны в биотехнологии, поскольку при использовании ДНК-лигаза при соединении двух молекул в одну выход значительно ниже при тупых концах. При выполнении субклонирования он также имеет недостаток, заключающийся в потенциальной вставке вставки ДНК в желаемой противоположной ориентации. С другой стороны, тупые концы всегда совместимы друг с другом. Вот пример небольшого фрагмента ДНК с тупым концом:

5'-GATCTGACTGATGCGTATGCTAGT-3'3'-CTAGACTGACTACGCATACGATCA-5'

Свесы и липкие концы

Тупые концы создаются различными свесы. Свес - это отрезок непарных нуклеотиды в конце молекулы ДНК. Эти неспаренные нуклеотиды могут находиться в любой цепи, создавая 3 'или 5' выступы. Эти выступы в большинстве случаев палиндромные.

Самый простой случай выступа - это единственный нуклеотид. Это чаще всего аденозин и создается как 3-футовый выступ некоторыми ДНК-полимеразы. Чаще всего это используется при клонировании ПЦР продукты, созданные таким ферментом. Продукт соединен с линейной молекулой ДНК с 3 ' тимин свес. Поскольку аденин и тимин образуют базовая пара, это облегчает соединение двух молекул лигазой с образованием кольцевой молекулы. Вот пример А-образного свеса:

5'-ATCTGACTA-3'3'-ТАГАКТГА-5'

Более длинные свесы называются связные концы или липкие концы. Чаще всего их создают эндонуклеазы рестрикции когда они разрезают ДНК. Очень часто они отрезают две нити ДНК на четыре пары оснований друг от друга, создавая 5 'выступ из четырех оснований в одной молекуле и дополнительный 5' выступ в другой. Эти концы называются связными, поскольку они легко соединяются вместе лигазой.

Например, эти два «липких» конца совместимы:

5'-ATCTGACT      + GATGCGTATGCT-3'3'-TAGACTGACTACG        КАТАКГА-5'

Они могут образовывать дополнительные пары оснований в выступающей области:

           GATGCGTATGCT-3'5'-ATCTGACT     КАТАКГА-5'3'-TAGACTGACTACG

Кроме того, поскольку разные эндонуклеазы рестрикции обычно создают разные выступы, можно создать плазмиду, вырезая кусок ДНК (используя разные ферменты для каждого конца), а затем присоединяя его к другой молекуле ДНК с концами, обрезанными теми же ферментами. Поскольку выступы должны быть комплементарными, чтобы лигаза работала, две молекулы могут соединяться только в одной ориентации. Это часто очень желательно в молекулярная биология.

Потертые концы

На каждой отдельной нити ДНК мы обычно видим аденин пара с тимин, и пара цитозина с гуанин чтобы сформировать параллельную дополнительную нить, как описано ниже. Две нуклеотидные последовательности, которые соответствуют друг другу таким образом, называются комплементарными:

5'-ATCTGACT-3'3'-ТАГАКТГА-5'

Потрепанный конец относится к участку двухцепочечной (или другой многонитевой) молекулы ДНК около конца со значительной долей некомплементарных последовательностей; то есть последовательность, в которой нуклеотиды на соседних цепях не совпадают правильно:

5'-ATCTGACTAGGCA-3'3'-ТАГАКТГАCTACG-5'

Термин «потертый» используется потому, что неправильно подобранные нуклеотиды имеют тенденцию избегать связывания, таким образом выглядя похожими на нити в изношенном куске веревки.

Хотя некомплементарные последовательности также возможны в середине двухцепочечной ДНК, несовпадающие области на удалении от концов не называются «потрепанными».

Открытие

Рональд В. Дэвис впервые обнаружил липкие концы как продукт действия EcoRI, ограничение эндонуклеаза.^[2]

Прочность

Липкие концевые ссылки отличаются своей стабильностью. Для оценки устойчивости можно измерить свободную энергию образования. Для различных последовательностей могут быть сделаны приближения свободной энергии на основе данных, относящихся к кривым тепловой денатурации олигонуклеотидов в УФ-диапазоне.^[3] Кроме того, предсказания, сделанные на основе моделирования молекулярной динамики, показывают, что некоторые липкие концевые звенья растягиваются сильнее, чем другие.^[4]

использованная литература

Самбрук, Джозеф; Дэвид Рассел (2001). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. Нью-Йорк: Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, ISBN 0879695765.

^ Салливан, Мэри. Мяч. ISBN 9780544819016. OCLC 949423125.
^ Домашняя страница Фонда Грубера | Фонд Грубера В архиве 2012-05-11 в Wayback Machine
^ Джон Санта-Люсия-младший (1997). «Единый взгляд на термодинамику ближайших соседей полимерной, гантелевой и олигонуклеотидной ДНК». Труды Национальной академии наук США. 95 (4): 1460–1465. Дои:10.1073 / pnas.95.4.1460. ЧВК 19045. PMID 9465037.
^ Эхсан Бан и Каталин Р. Пику (2014). «Сила липких концевых связей ДНК». Биомакромолекулы. 15 (1): 143–149. Дои:10.1021 / bm401425k. PMID 24328228.

[1] Салливан, Мэри. Мяч. ISBN 9780544819016. OCLC 949423125.

[2] Домашняя страница Фонда Грубера | Фонд Грубера В архиве 2012-05-11 в Wayback Machine

[3] Джон Санта-Люсия-младший (1997). «Единый взгляд на термодинамику ближайших соседей полимерной, гантелевой и олигонуклеотидной ДНК». Труды Национальной академии наук США. 95 (4): 1460–1465. Дои:10.1073 / pnas.95.4.1460. ЧВК 19045. PMID 9465037.

[4] Эхсан Бан и Каталин Р. Пику (2014). «Сила липких концевых связей ДНК». Биомакромолекулы. 15 (1): 143–149. Дои:10.1021 / bm401425k. PMID 24328228.

[1]

[2]

[3]

[4]