Сборка Гибсона - Gibson assembly

Гибсон Ассамблея это молекулярное клонирование метод, который позволяет объединить несколько ДНК фрагменты в единственной изотермической реакции. Он назван в честь его создателя Дэниела Г. Гибсона, который был главным техническим директором и соучредителем Кодекс ДНК.

Процесс

Обзор сборки Gibson

Вся реакция сборки Гибсона требует нескольких компонентов с небольшими манипуляциями.[1]


Метод позволяет одновременно комбинировать до 15 фрагментов ДНК в зависимости от идентичности последовательностей. Требуется, чтобы ДНК фрагменты содержат ~ 20-40 пар оснований перекрываются с соседними фрагментами ДНК. Эти фрагменты ДНК смешиваются с коктейлем из трех ферментов вместе с другими компонентами буфера.

Три необходимых активности ферментов: экзонуклеаза, ДНК-полимераза, и ДНК-лигаза.

  • Экзонуклеаза отщепляет ДНК с 5'-конца, таким образом, не ингибируя активность полимеразы и позволяя реакции протекать в одном единственном процессе.[1] Образующиеся одноцепочечные области на соседних фрагментах ДНК могут отжигаться.
  • ДНК-полимераза включает нуклеотиды для заполнения любых пробелов.
  • ДНК-лигаза ковалентно соединяется с ДНК соседних сегментов, тем самым удаляя любые разрывы в ДНК.

Полученный продукт - это разные фрагменты ДНК, объединенные в один. Могут быть собраны как линейные, так и замкнутые круговые молекулы.

Есть два подхода к сборке Гибсона. Одноэтапный метод и двухэтапный метод. Оба метода можно проводить в одном реакционном сосуде. Одношаговый метод сборки Гибсона позволяет собрать до 5 различных фрагментов за один этап. изотермический процесс. В этом методе фрагменты и мастер-смесь ферментов объединяются, и вся смесь инкубируется при 50 ° C в течение одного часа. Для создания более сложных конструкций, содержащих до 15 фрагментов, или для конструкций, включающих фрагменты от 100 до 10 т.п.н., используется двухэтапный подход Gibson Assembly. Двухступенчатая реакция требует двух отдельных добавлений мастер-микса; один для стадии экзонуклеазы и отжига, а второй для стадии ДНК-полимеразы и лигирования. Для двухэтапного подхода используются разные температуры инкубации для выполнения процесса сборки.

Преимущества

Этот метод сборки ДНК имеет много преимуществ по сравнению с обычным клонированием рекомбинантной ДНК рестрикционным ферментом / лигированием.

  • Никакого рестрикционного переваривания фрагментов ДНК после ПЦР не требуется. Однако основной вектор можно расщепить или синтезировать с помощью ПЦР.
  • Это дешевле и быстрее, чем обычные схемы клонирования, так как требует меньшего количества этапов и меньшего количества реагентов.
  • Между двумя фрагментами ДНК не остается рубца сайта рестрикции, но область между двойными цепями и свисающими концами слегка подвержена мутации, когда ДНК-полимераза закрывает промежутки.
  • До 5 фрагментов ДНК можно объединить одновременно в реакции в одной пробирке с использованием одностадийной мастер-смеси ферментов.
  • Одновременно можно объединить до 15 фрагментов с помощью двухступенчатой ​​реакции. При двухэтапном подходе сначала выполняются этапы экзонуклеазы и отжига. После этого на втором этапе добавляют ДНК-полимеразу и лигазу.
  • Метод сборки Гибсона также можно использовать для сайт-направленный мутагенез для включения сайт-специфических мутаций, таких как вставки, делеции и точечные мутации

Рекомендации

  1. ^ а б Гибсон Д.Г., Янг Л., Чуанг Р.Й., Вентер Дж.С., Хатчисон, Калифорния, 3-й, Смит Х.О. (2009). «Ферментативная сборка молекул ДНК до нескольких сотен килобаз». Методы природы. 6 (5): 343–345. Дои:10.1038 / nmeth.1318. PMID  19363495.

Дальнейшая информация