Микроскопия интерференционного отражения - Interference reflection microscopy

Принцип интерференционной отражательной микроскопии (IRM), показывающий влияние интерференции на отраженные волны и результат на интенсивность окончательного изображения. Темно-пурпурная волна представляет собой свет от источника света. Светло-фиолетовые волны - это отражение от клеточной мембраны и от поверхности стекла. При попадании на поверхность стекла отраженные волны сдвигаются на половину длины волны. Когда мембрана находится очень близко к стеклу, отраженный свет будет отражаться в противофазе с отраженным лучом от стекла. Это вызовет деструктивную интерференцию (см. Красную линию), в результате чего пиксель станет темным. Если расстояние между мембраной и стеклом больше, возвратные волны будут меньше смещаться и вызовут конструктивную интерференцию (см. Красную линию), что приведет к более ярким пикселям на конечном изображении. Указаны типичные показатели преломления стекла, среды и клеточной мембраны, которые определяют степень отражения.

Микроскопия интерференционного отражения (IRM) является оптическая микроскопия техника, которая использует поляризованный свет для формирования изображения предмета на стеклянной поверхности. В интенсивность сигнала - это мера близости объекта к поверхности стекла. Этот метод можно использовать для изучения событий на клеточной мембране без использования (флуоресцентной) метки в отличие от TIRF микроскопия.

История

Впервые метод был использован для исследования тонких пленок масла.^[1][2] В 1964 году Кертис впервые применил этот метод в клеточной биологии для изучения эмбриональных фибробластов куриного сердца.^[3] Он использовал IRM, чтобы посмотреть на места адгезии и расстояния между фибробластами, отметив, что контакт со стеклом в основном ограничивался периферией клетки и псевдоподия.^[3]

Техника была усовершенствована, а качественные и количественные аспекты техники были позже описаны несколькими исследователями 70-х и 80-х годов:^[4] Берейтер-Хан и его коллеги соотносили эту технику с электронная микроскопия, показывая, что различные клеточные линии млекопитающих прикрепляются к стеклянной подложке в определенных местах фокальной адгезии.^[5]

Теория

Чтобы сформировать изображение прикрепленной ячейки, свет определенного длина волны проходит через поляризатор. Этот линейно поляризованный свет отражается Разделитель луча навстречу цель, который фокусирует свет на образец. Стеклянная поверхность в определенной степени отражает поляризованный свет. Свет, который не отражается стеклом, попадает в клетку и отражается клеточной мембраной. Возможны три ситуации. Во-первых, когда мембрана находится близко к стеклу, отраженный свет от стекла смещается на половину длины волны, так что свет, отраженный от мембраны, будет иметь фазовый сдвиг по сравнению с отраженным светом от стекла. фазы и поэтому компенсируют друг друга (вмешательство ). Эта интерференция приводит к появлению темных пикселей на конечном изображении (левый случай на рисунке). Во-вторых, когда мембрана не прикреплена к стеклу, отражение от мембраны имеет меньший фазовый сдвиг по сравнению с отраженным светом от стекла, и поэтому они не будут компенсировать друг друга, что приведет к яркому пикселю на изображении ( правый регистр на рисунке). В-третьих, когда нет образца, обнаруживается только отраженный свет от стекла, и он будет отображаться в виде ярких пикселей на конечном изображении.

Отраженный свет вернется к светоделителю и пройдет через второй поляризатор, который устраняет рассеянный свет, прежде чем достигнет детектора (обычно CCD камера ), чтобы сформировать окончательную картину. Поляризаторы могут повысить эффективность за счет уменьшения рассеянного света; однако в современной установке с чувствительной цифровой камерой они не требуются.^[6]

Теория

Отражение вызывается изменением показателя преломления, поэтому на каждой границе часть света будет отражаться. Степень отражения определяется коэффициентом отражения ${ displaystyle r_ {12} !}$, согласно следующему правилу:^[4]

${ displaystyle r_ {12} = { frac {n_ {1} -n_ {2}} {n_ {1} + n_ {2}}}}$

Отражательная способность ${ Displaystyle R !}$ - отношение интенсивности отраженного света (${ displaystyle I_ {r} !}$) и интенсивности падающего света (${ displaystyle I_ {i} !}$):^[4]

${ displaystyle R = { frac {I_ {r}} {I_ {i}}} = left lbrack { frac {n_ {1} -n_ {2}} {n_ {1} + n_ {2} }} right rbrack ^ {2} = {r_ {12}} ^ {2}}$

Используя типичные показатели преломления для стекла (1,50-1,54, см. список ), вода (1.31, см. список ), клеточная мембрана (1,48)^[7] и цитозоль (1.35),^[7] можно рассчитать долю света, отражаемого каждой границей раздела. Степень отражения увеличивается по мере увеличения разницы между показателями преломления, что приводит к сильному отражению от границы раздела между поверхностью стекла и культуральной средой (примерно равно воде: 1,31–1,33). Это означает, что без кюветы изображение будет ярким, тогда как при присоединении кюветы разница между средой и мембраной вызывает сильное отражение, которое немного сдвинуто по фазе, вызывая интерференцию со светом, отраженным стеклом. Поскольку амплитуда света, отраженного от границы раздела среда-мембрана, уменьшается из-за рассеяния, присоединенная область будет казаться более темной, но не полностью черной. Поскольку световой конус, сфокусированный на образце, вызывает падающий свет под разными углами, существует широкий диапазон интерференционных картин. Когда рисунки различаются менее чем на 1 длину волны (полоса нулевого порядка), рисунки сходятся, что приводит к увеличению интенсивности. Этого можно добиться, используя объектив с числовой апертурой больше 1.^[4]

Требования

Чтобы получить изображение клеток с помощью IRM, микроскопу необходимы как минимум следующие элементы: 1) источник света, например галогенная лампа, 2) оптический фильтр (который пропускает небольшой диапазон длин волн), и 3) светоделитель (который отражает 50% и передает 50% выбранной длины волны)

Источник света должен давать свет высокой интенсивности, так как светоделитель и сам образец теряют много света. Разные длины волн приводят к разным изображениям IRM; Bereiter-Hahn и его коллеги показали, что для их клеток PtK 2 свет с длиной волны 546 нм дает лучший контраст, чем синий свет с длиной волны 436 нм.^[5] В базовую теорию IRM внесено множество усовершенствований, большинство из которых увеличивают эффективность и результативность формирования изображения. Поместив поляризаторы и четвертьволновая пластина между светоделителем и образцом линейно поляризованный свет может быть преобразован в круговой поляризованный свет а затем преобразовать обратно в линейно поляризованный свет, что увеличивает эффективность системы. В круговой поляризатор В статье подробно рассматривается этот процесс. Кроме того, за счет включения второго поляризатора, который повернут на 90 ° по сравнению с первым поляризатором, можно предотвратить попадание паразитного света на детектор, увеличивая отношение сигнал / шум (см. Рисунок 2 Verschueren).^[4]).

Биологические приложения

Есть несколько способов использования IRM для изучения биологических образцов. Ранние примеры использования техники были сосредоточены на клеточная адгезия^[3] и миграция клеток.^[8]

Слияние пузырьков

Две хромаффинные клетки, полученные с помощью DIC (слева) и IRM (справа).

Совсем недавно этот метод был использован для изучения экзоцитоз в хромаффинные клетки.^[6] При визуализации с помощью ДВС хромаффинные клетки выглядят как круглые клетки с небольшими выступами. Когда эта же ячейка визуализируется с помощью IRM, след ячейки на стекле можно четко увидеть в виде темной области с небольшими выступами. Когда везикулы сливаются с мембраной, они выглядят как маленькие светлые круги в темном следе (яркие пятна в верхней ячейке на правой панели).

Пример слияния везикул в хромаффинных клетках с использованием IRM показан в видеоролике 1. При стимуляции 60мМ калий внутри темного следа хромаффинной клетки начинают появляться многочисленные яркие пятна в результате экзоцитоза гранулы с плотным ядром. Поскольку IRM не требует флуоресцентной метки, его можно комбинировать с другими методами визуализации, такими как эпифлуоресценция и микроскопия TIRF для изучения динамики белка вместе с экзоцитозом и эндоцитозом везикул. Еще одно преимущество отсутствия флуоресцентных меток - снижение фототоксичность.

Рекомендации

дальнейшее чтение

• Количественная отражательная интерференционная контрастная микроскопия (RICM) в мягком веществе и клеточной адгезии, Лоран Лимозин и Хейя Сенгупта, ChemPhysChem 2009, 10, 2752 - 2768

внешняя ссылка

• Медицинский колледж Альберта Эйнштейна по IRM
• Конфокальная микроскопия в отраженном свете на Nikon MicroscopyU