ПЭГилирование лизоцима - Lysozyme PEGylation

Эта статья о ПЭГилировании в фармацевтическом контексте. Подробное описание лизоцима см. Лизоцим.

ПЭГилирование лизоцима ковалентное присоединение Полиэтиленгликоль (ПЭГ) в лизоцим, который является одним из наиболее широко исследуемых ПЭГилированных белков.

В Пегилирование белков стало обычной практикой для современных терапевтических препаратов, так как этот процесс способен повысить растворимость, термическую стабильность, устойчивость к ферментативному разложению и период полужизни в сыворотке интересующих белков.[1][2] Лизоцим, как природный бактерицидный фермент, лизирует клеточную стенку различных грамположительные бактерии и предлагает защиту от микробных инфекций.[2] Лизоцим имеет шесть остатков лизина, которые доступны для реакций ПЭГилирования.[3] Таким образом Пегилирование из лизоцим, или ПЭГилирование лизоцима, может быть хорошей модельной системой для ПЭГилирования других белков с ферментативной активностью, демонстрируя повышение его физической и термической стабильности при сохранении своей активности. [2]

Предыдущие работы по ПЭГилированию лизоцима показали различные хроматографические схемы для очистки ПЭГилированного лизоцима, которые включали ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, и эксклюзионная хроматография (быстрая жидкостная хроматография белков ) и доказал его устойчивую конформацию с помощью круговой дихроизм и улучшенная термическая стабильность за счет анализа ферментативной активности, SDS-СТРАНИЦА, и эксклюзионная хроматография (высокоэффективная жидкостная хроматография ).[1][4][5]

Методология

Пегилирование

Химическая модификация лизоцим от Пегилирование включает добавление к белку метокси-ПЭГ-альдегида (мПЭГ-альдегида) с различными размерами молекул, в диапазоне от 2 кДа до 40 кДа.[6][7] Белок и мПЭГ-альдегид растворяют, используя фосфат натрия буфер с цианоборгидрид натрия, который действует как Восстановитель и условия, при которых альдегидная группа мПЭГ-альдегида имеет сильное сродство к остатку лизина на N-конце лизоцима.[7] Обычно используемое молярное соотношение лизоцима и мПЭГ-альдегида составляет 1: 6 или 1: 6,67.[6][5] Когда достаточно Пегилирование По достижении, реакция может быть остановлена ​​добавлением лизина к раствору или кипячением раствора.[2][8] Различные профили могут привести к Пегилирование белка, который включает интактный моно-ПЭГилированный, ди-ПЭГилированный, три-ПЭГилированный, а также, возможно, их изоформы.[5]

Очищение

Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография часто используется на первом этапе или этапе улавливания для разделения ПЭГилированных белков в виде Пегилирование может влиять на заряды целевых белков, нейтрализуя электростатическое взаимодействие, изменение изоэлектрическая точка (pI) и увеличивая pKa ценность[2]. Из-за высокого Пи лизоцима (pI = 10,7) использовали катионообменную хроматографию.[2][9] Поскольку повышенная степень Пегилирование снижает ионную силу белка, поли-ПЭГилированные белки имеют тенденцию связываться с катионной смолой слабее, чем моно-ПЭГилированный белок или интактная форма. Таким образом, поли-ПЭГилированные белки элюируются быстрее, а интактный белок вымывается последним при катионообменной хроматографии.[10] Поскольку моно-ПЭГилирование широко исследуется и описывается как защита белков-мишеней, мишень элюировать в катионообменной хроматографии обычно используются моно-ПЭГилированные белки.[7]

Хроматография гидрофобного взаимодействия

Несмотря на возможность катионообменной хроматографии в процессе очистки, хроматография гидрофобного взаимодействия также используется, обычно на втором этапе в качестве этапа полировки. Используя катионную смолу с относительно маленьким размером гранул, катионообменная хроматография может идентифицировать и различать изоформы по кажущимся зарядам в условии, но хроматография гидрофобного взаимодействия способен идентифицировать и разделять изоформы по их гидрофобности.[11]

Эксклюзионная хроматография (FPLC)

Из-за очевидной разницы в размерах по степени Пегилирование белка, эксклюзионная хроматография (быстрая жидкостная хроматография белков или FPLC).[4][5] Существует отрицательная корреляция между молекулярный вес и время удерживания ПЭГилированного белка на хроматограмме; более крупный белок или большее количество пегилированного белка элюируется первым, а меньший белок или интактный белок - последним.[2]

Характеристика

Идентификация

Наиболее распространенные анализы для идентификации интактного и ПЭГилированного лизоцима могут быть выполнены с помощью эксклюзионная хроматография (высокоэффективная жидкостная хроматография или ВЭЖХ), SDS-СТРАНИЦА и Матричная лазерная десорбция / ионизация (MALDI).[2]

Конформация

Вторичная структура интактного и ПЭГилированного лизоцима может быть охарактеризована: круговой дихроизм (CD) спектроскопия.[4][7] Спектры КД от 189 до 260 нм с шагом 0,1 нм не показали значительного изменения вторичной структуры интактного и ПЭГилированного лизоцима.[4][7]

Анализ ферментативной активности

Гликоль хитозан

Ферментативная активность интактного и ПЭГ-илированного лизоцима можно оценить с использованием гликоль-хитозана путем взаимодействия 1 мл 0,05% (мас. / об.) гликоль-хитозана в 100 мМ ацетатного буфера с pH 5,5 и 100 мкл интактного или ПЭГилированного белка при 40 ° C в течение 30 мин и затем добавляя 2 мл 0,5 М карбоната натрия с 1 мкг феррицианид калия.[12] Смесь немедленно нагревают, кипятят в течение 15 минут и охлаждают для спектрального анализа при 420 нм.[12] Поскольку ферментативная активность по гидролизу связи β-1,4-N-ацетилглюкозамина сохранялась после пегилирования, не было спада ферментативной активности за счет увеличения степени пегилирования.[4]

Микрококк лизодейктический

Измеряя уменьшение мутности М. lysodeikticus инкубируя с лизоцимом, ферментативная активность можно оценить.[13] 7,5 мкл белков 0,1–1 мг / мл добавляют к 200 мкл М. lysodeikticus на своем оптическая плотность (OD) 1,7 AU, и смесь измеряют при 450 нм периодически для расчета скорости реакции.[5][13] В противоположность результату ферментативной активности гликоль-хитозана, увеличение степени ПЭГилирования снижает ферментативную активность.[4][5] Это различие в тенденции ферментативной активности может быть связано с пегилированием до свободного лизина, вызывающим стерические затруднения и впоследствии препятствующим образованию фермент-субстратный комплекс в случае реакции с макромолекулой, такой как M. lysodeikticus.[4][5][14]

использованная литература

  1. ^ а б Плата, Конан (18 сентября 2009 г.). Пегилированные белковые препараты: фундаментальная наука и клиническое применение. Birkhäuser. п. 113–124. ISBN  978-3-7643-8678-8.
  2. ^ а б c d е ж г час да Силва Фрейтас, Дебора; Абрахао-Нету, Хосе (15 июня 2010 г.). «Биохимическая и биофизическая характеристика лизоцима, модифицированного ПЭГилированием». Международный журнал фармацевтики. 392 (1–2): 111–117. Дои:10.1016 / j.ijpharm.2010.03.036. PMID  20307635.
  3. ^ «Исследования характеристик ПЭГилированного лизоцима». Ученый-аналитик. Получено 2020-07-17.
  4. ^ а б c d е ж г да Силва Фрейтас, Дебора; Абрахао-Нету, Хосе (15.06.2010). «Биохимическая и биофизическая характеристика лизоцима, модифицированного ПЭГилированием». Международный журнал фармацевтики. 392 (1–2): 111–117. Дои:10.1016 / j.ijpharm.2010.03.036. PMID  20307635.
  5. ^ а б c d е ж г Pai, Sheetal S .; Хаммуда, Буалем; Хун, Куньлунь; Поццо, Данило Ц .; Przybycien, Todd M .; Тилтон, Роберт Д. (2011-11-16). «Конформация цепи поли (этиленгликоля) в моно-ПЭГилированном лизоциме и моно-ПЭГилированном гормоне роста человека». Биоконъюгат Химия. 22 (11): 2317–2323. Дои:10.1021 / bc2003583. ISSN  1043-1802. PMID  21950579.
  6. ^ а б Моргенштерн, Жозефина; Бауман, Паскаль; Бруннер, Карина; Хаббух, Юрген (19.01.2017). «Влияние молекулярной массы ПЭГ и степени ПЭГилирования на физическую стабильность ПЭГилированного лизоцима». Международный журнал фармацевтики. 519 (1–2): 408–417. Дои:10.1016 / j.ijpharm.2017.01.040. PMID  28130198.
  7. ^ а б c d е Майзер, Бенджамин; Дисмер, Флориан; Хаббух, Юрген (2014). «Оптимизация случайных реакций ПЭГилирования посредством высокопроизводительного скрининга». Биотехнологии и биоинженерия. 111 (1): 104–114. Дои:10.1002 / бит. 25000. ISSN  1097-0290. PMID  23939788. S2CID  205503389.
  8. ^ Оттоу, Ким Экелунд; Лунд ‐ Олесен, Торстен; Мори, Трине Люткен; Хансен, Миккель Фугт; Хобли, Тимоти Дж. (2011). «Процесс на основе магнитного адсорбента для полунепрерывного ПЭГилирования белков». Биотехнологический журнал. 6 (4): 396–409. Дои:10.1002 / биот.201000360. ISSN  1860-7314. PMID  21259443.
  9. ^ Abeyrathne, E.D.N.S .; Lee, H.Y .; Ан, Д.У. (2014-12-11). «Последовательное отделение лизоцима, овомуцина, овотрансферрина и овальбумина от яичного белка». Птицеводство. 93 (4): 1001–1009. Дои:10.3382 / пс. 2013-03403. PMID  24706978.
  10. ^ Плата, Конан Дж .; Ван Альстайн, Джеймс М. (2005-11-08). «PEG-белки: инженерия реакций и вопросы разделения». Химическая инженерия. 61 (3): 924–939. Дои:10.1016 / j.ces.2005.04.040.
  11. ^ Ли, К. С .; Tak, K. K .; Парк, М. О .; Lee, J. T .; Woo, B.H .; Yoo, S.D .; Lee, H. S .; ДеЛука, П. П. (1999-05-01). «Получение и характеристика модифицированных полиэтиленгликолем кальцитонинов лосося». Фармацевтические разработки и технологии. 4 (2): 269–275. Дои:10.1081 / pdt-100101361. ISSN  1083-7450. PMID  10231888.
  12. ^ а б Имото, Тайцзи; Ягишита, Кадзуёси (1971-04-24). «Простое измерение активности лизоцима». Сельскохозяйственная и биологическая химия. 35 (7): 1154–1156. Дои:10.1080/00021369.1971.10860050. ISSN  0002-1369.
  13. ^ а б Шугар, Давид (1952-03-29). «Измерение активности лизоцима и ультрафиолетовая инактивация лизоцима». Biochimica et Biophysica Acta. 8 (3): 302–309. Дои:10.1016/0006-3002(52)90045-0. PMID  14934741.
  14. ^ Нодакэ, Юичи; Ямасаки, Нобуюки (1999-11-25). «Некоторые свойства макромолекулярного конъюгата лизоцима, полученного путем модификации производным монометоксиполиэтиленгликоля». Биология, биотехнология и биохимия. 64 (4): 767–774. Дои:10.1271 / bbb.64.767. ISSN  0916-8451. PMID  10830491. S2CID  2851002.