МАЛЬБАК - MALBAC

Многократные циклы отжига и циклического усиления (МАЛЬБАК) - квазилинейное целое геном метод усиления. В отличие от обычных ДНК методы амплификации, которые являются нелинейными или экспоненциальными (в каждом цикле скопированная ДНК может служить в качестве матрицы для последующих циклов), MALBAC использует специальные праймеры, которые позволяют ампликоны иметь комплементарные концы и, следовательно, образовывать петлю, предотвращая экспоненциальное копирование ДНК. Это приводит к амплификации только исходной геномной ДНК и, следовательно, снижает систематическую ошибку амплификации. MALBAC «используется для создания перекрывающихся ампликонов дробовика, покрывающих большую часть генома».[1] Для секвенирования следующего поколения за MALBAC следует регулярная ПЦР который используется для дальнейшего усиления ампликонов.

Технологическая платформа

Смотрите также: Полимеразной цепной реакции

До MALBAC отдельная клетка выделялась различными методами, включая лазерная микродиссекция, микрофлюидный устройства, проточной цитометрии, или микропипетирование, а затем лизирование. Одноклеточная полногеномная амплификация MALBAC включает 5 циклов гашения, удлинения, плавления и образования петель.

Праймеры MALBAC

Основное преимущество MALBAC заключается в том, что ДНК амплифицируется почти линейно. Использование специализированных грунтовки позволяет зацикливать ампликоны, что затем предотвращает их дальнейшую амплификацию в последующих циклах MALBAC. Эти праймеры имеют длину 35 нуклеотидов, с 8 вариабельными нуклеотидами, которые гибридизуются с матрицами, и 27 общими нуклеотидами.[1] Общая нуклеотидная последовательность - это GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG. 8 вариабельных нуклеотидов случайным образом отжигаются с одноцепочечной молекулой геномной ДНК. После одного удлинения получается полуампликон, ампликон, содержащий общую нуклеотидную последовательность только на 5 ’конце. Этот полуампликон используется в качестве шаблона для другого раунда расширения, в результате чего получается полный ампликон, ампликон, в котором 3 ’конец комплементарен последовательности на 5’ конце.

Смещение прядей

Праймеры MALBAC имеют переменные компоненты, которые позволяют им случайным образом связываться с матричной ДНК. Это означает, что на одном фрагменте в любом цикле может быть несколько праймеров, отожженных к фрагменту. А ДНК-полимераза например, полученный из Bacillus stearothermophilus (Bst полимераза) способна смещать 5’-конец другой восходящей нити, растущей в том же направлении.[2]

Частота ошибок

Bst ДНК-полимераза имеет частоту ошибок 1/10000 оснований.[3]

Экспериментальный рабочий процесс

Обзор рабочего процесса эксперимента MALBAC.
  1. Выделение и лизис одиночных клеток - пг фрагментов геномной ДНК (от 10 до 100 т.п.н.), выделенных из одной клетки, используются в качестве матриц.
  2. Плавление - При 94 ° C двухцепочечные молекулы ДНК расплавляются в одноцепочечные формы.
  3. Закалка - После плавления реакцию немедленно гасят до 0 ° C и к ней добавляют праймеры MALBAC.
  4. Расширение – Bst ДНК-полимераза (большой фрагмент) удлиняет праймеры при 65 ° C в течение 2 минут, создавая полуампликоны.
  5. Плавление - Реакционную смесь нагревают до 94 ° C для отделения полуампликона от матрицы геномной ДНК.
  6. Закалка - Реакцию быстро гасят при 0 ° C, а затем добавляют ту же смесь полимераз. Праймеры MALBAC эффективно связываются как с полуампликонами, так и с матрицей геномной ДНК.
  7. Расширение - Bst ДНК-полимераза (большой фрагмент) удлиняет праймеры при 65 ° C в течение 2 минут. На этом этапе создаются полные ампликоны для тех, которые использовали полуампликоны в качестве матриц, а также полуампликоны для тех, которые использовали шаблон геномной ДНК в качестве матриц.
  8. Плавление - Реакционную смесь нагревают до 94 ° C, чтобы отделить ампликоны от шаблона.
  9. Зацикливание - Для полных ампликонов последовательность 3 ’конца теперь дополняет 5’ конец. При 58 ° C два конца гибридизуются, образуя петлю ДНК. Это предотвращает использование полного ампликона в качестве шаблона в последующих циклах MALBAC.
  10. Повторите шаги 6-9 пять раз. - 5 циклов линейного усиления MALBAC.
  11. Обычная ПЦР - Продукт MALBAC дополнительно амплифицируется с помощью ПЦР. При использовании 27 общих нуклеотидов в качестве праймеров амплифицируются только полные ампликоны.

В конце ПЦР пикограммы генетического материала амплифицируются до микрограмма ДНК, что дает достаточно ДНК для секвенирования.

Приложения

Смотрите также: Соматическая эволюция рака и Генетическая гетерогенность
Выявление генов лекарственной устойчивости с помощью MALBAC

MALBAC предлагает беспристрастный подход к амплификации ДНК из одной клетки. Этот метод секвенирования отдельной клетки имеет огромное количество приложений, многие из которых еще предстоит использовать. MALBAC может помочь в анализе судебно-медицинских образцов, в пренатальном скрининге на генетические заболевания, в понимании развития репродуктивных клеток или в выяснении сложности опухоли.[1][4] По своей сути, эта технология позволяет исследователям наблюдать за частотой, с которой мутации накапливаются в отдельных клетках.[1] Кроме того, он позволяет обнаруживать хромосомные аномалии и генные варианты числа копий (CNV) внутри и между клетками, а также способствует обнаружению необычных мутаций, которые приводят к однонуклеотидный полиморфизм (SNP).[1]

В области исследования рака, MALBAC имеет множество приложений. Его можно использовать для изучения внутриопухолевой гетерогенности, для идентификации генов, которые могут вызывать агрессивный или метастатический фенотип, или для оценки возможности развития опухоли. устойчивость к лекарству.[4][5] Новаторское применение MALBAC было опубликовано в выпуске журнала Science за декабрь 2012 года и описывало использование этой технологии для измерения скорости мутации линии клеток рака толстой кишки SW4802.[1] Посредством секвенирования амплифицированной ДНК трех родственных клеток рака толстой кишки параллельно с неродственными клетками рака толстой кишки из другой линии, SNP были идентифицированы без обнаружения ложноположительных результатов.[1] Также было замечено, что пурин-пиримидин трансверсии встречались с высокой частотой среди SNP.[1] Характеристика числа копий и вариаций одиночных нуклеотидов одиночных раковых клеток толстой кишки подчеркнула гетерогенность, присутствующую в опухоли.[1]

MALBAC применялся как метод изучения генетического разнообразия репродуктивных клеток. Посредством секвенирования геномов 99 индивидуальных сперматозоидов человека от анонимного донора MALBAC был использован для исследования генетическая рекомбинация события, связанные с отдельными гаметами, и в конечном итоге дают представление о динамике генетической рекомбинации и ее вкладе в мужское бесплодие.[6] Кроме того, в отдельном сперматозоиде MALBAC идентифицировал дублированные или отсутствующие хромосомы, а также SNP или CNV, которые могли негативно повлиять на фертильность.[6]

Преимущества

MALBAC привел ко многим значительным достижениям по сравнению с другими методами секвенирования отдельных клеток, прежде всего в том, что он может определять 93% генома отдельной клетки человека.[1] Некоторые преимущества этой технологии включают снижение смещения амплификации и увеличение генома. покрытие, требование очень небольшого количества матричной ДНК и низкий уровень ложноположительных и ложноотрицательных мутаций.[4][6]

Снижает систематическую ошибку амплификации и увеличивает охват генома

MALBAC - это форма секвенирования всего генома, которая снижает систематическую ошибку, связанную с экспоненциальной амплификацией ПЦР, за счет использования квазилинейной фазы предварительной амплификации.[1] MALBAC использует пять циклов преамплификации и праймеры, содержащие общую последовательность из 27 нуклеотидов и вариабельную последовательность из 8 нуклеотидов, для получения фрагментов амплифицированной ДНК (ампликонов), которые петляют сами по себе, чтобы предотвратить дополнительное копирование и перекрестную гибридизацию.[1][7]Эти петли не могут использоваться в качестве матрицы для амплификации во время MALBAC и, следовательно, уменьшают систематическую ошибку амплификации, обычно связанную с неравномерной экспоненциальной амплификацией фрагментов ДНК посредством полимеразной цепной реакции.[1] Было описано, что MALBAC имеет лучшую однородность амплификации, чем другие методы одиночного секвенирования, такие как многократное усиление смещения (МДА).[1][5] MDA не использует петли ДНК и амплифицирует ДНК экспоненциально, что приводит к смещению.[1] Соответственно, систематическая ошибка амплификации, связанная с другими методами секвенирования отдельных клеток, приводит к низкому охвату генома.[1][5] Уменьшение систематической ошибки, связанной с MALBAC, привело к лучшему охвату последовательностей генома, чем другие методы секвенирования отдельных клеток.

Требуется очень мало шаблонной ДНК

MALBAC можно использовать для амплификации и последующего секвенирования ДНК, когда доступна только одна или несколько клеток, например, при анализе циркулирующих опухолевых клеток, пренатальных скринингах или судебно-медицинских образцах.[4][7] Для запуска процесса требуется лишь небольшое количество исходной матрицы (пикограммы ДНК), и поэтому это идеальный метод для секвенирования отдельной клетки человека.[1]

Низкая частота ложноположительных и ложноотрицательных мутаций

Секвенирование отдельных клеток часто имеет высокий уровень ложноотрицательных мутаций.[1] Частота ложноотрицательных мутаций определяется как вероятность того, что настоящая мутация не будет обнаружена, и это может произойти из-за смещения амплификации, вызванного потерей или выпадением аллеля.[8] Единообразие покрытия последовательности MALBAC по сравнению с другими методами секвенирования отдельных ячеек улучшило обнаружение SNP и уменьшило аллель уровень отчисления.[1] Показатель отсева аллелей увеличивается, когда аллель гетерозигота не может амплифицироваться, что приводит к идентификации «ложной гомозиготы». Это может происходить из-за низкой концентрации ДНК-матрицы или неравномерной амплификации матрицы, в результате которой один аллель гетерозиготы копируется больше, чем другой.[8] Показатель выпадения аллеля MALBAC был намного ниже (примерно 1%) по сравнению с MDA, который составляет примерно 65%. В отличие от MDA, у которого было показано, что эффективность обнаружения SNP составляет 41% по сравнению с массовым секвенированием, MALBAC, как сообщается, имеет дефицит обнаружения SNP на 76%.[1] Сообщается также, что MALBAC имеет низкий ложноположительный рейтинг. Ложноположительные мутации, генерируемые MALBAC, в основном являются результатом ошибок, вносимых ДНК-полимеразой во время первого цикла амплификации, которые в дальнейшем распространяются в последующих циклах. Эту частоту ложных срабатываний можно исключить путем секвенирования 2-3 клеток в пределах линии, полученной из одной клетки, для проверки наличия SNP, а также путем устранения ошибок секвенирования и амплификации путем секвенирования неродственных клеток из отдельной линии.[1]

Ограничения

  • Из-за потребности в небольшом количестве матричной ДНК загрязнение целевой ДНК оператором или окружающей средой может потенциально исказить результаты секвенирования.[1]
  • Чтобы полностью исключить ложноположительные результаты, необходимо сравнить результаты секвенирования клеток с результатами, полученными от 2–3 клеток одного и того же клона, а также с клетками неродственного клона.[1]
  • ДНК полимераза Используемая для амплификации матричной ДНК подвержена ошибкам и может вносить ошибки секвенирования в первый цикл MALBAC, которые впоследствии размножаются.[1][4]
  • Покрытие генома на уровне отдельной клетки с использованием MALBAC менее однородно, чем массовое секвенирование. Хотя MALBAC повысил эффективность обнаружения при секвенировании отдельных клеток, он не может обнаружить примерно одну треть SNP по сравнению с массовым секвенированием.[1][4]

внешняя ссылка

  • [1] База данных NCBI
  • [2] Yikon Genomics: амплификация всего генома (WGA) и многократные циклы амплификации на основе отжига и зацикливания (MALBAC)

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я j k л м п о п q р s т ты v ш Икс у Zong, C .; Lu, S .; Chapman, A.R .; Се, С. (2012). «Общегеномное обнаружение однонуклеотидных вариаций и вариаций числа копий одной человеческой клетки». Наука 338, 1622. DOI: 10.1126 / science.1229164. PMID  23258894
  2. ^ "Aviel-Ronen, S .; Qi Zhu, C .; Coe, BP; Liu, N .; Watson, SK; Lam, WL; Tsao, MS (2006)" Большой фрагмент Bst ДНК-полимеразы для амплификации всего генома ДНК из фиксированные формалином ткани, залитые парафином ». BMC Genomics 7. DOI: 10.1186 / 1471-2164-7-312.PMID  17156491
  3. ^ ТЕКУЩИЕ ПРОТОКОЛЫ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ, Ausubel, F.M. и другие. Vol. I., John Wiley & Songs, Inc., 1995. Стр. 7.4.18.
  4. ^ а б c d е ж Бейкер, М. (2012). «Метод предлагает план единственной человеческой клетки». Новости природы. Дои:10.1038 / природа.2012.12088
  5. ^ а б c Навин, Н .; Kendall, J .; Troge, J .; Andrews, P .; Rodgers, L .; McIndoo, J .; Кук, К .; Степанский, А .; Леви, Д .; Эспозито, Д .; Muthuswamy, L .; Красниц, А .; McCombie, R .; Hicks, J .; Виглер, М. (2011). «Эволюция опухоли определяется секвенированием одной клетки». Письмо природы 472, 90-94. DOI: 10.1038 / nature09807. PMID  21399628
  6. ^ а б c Lu, S .; Zong, C .; Fan, W .; Ян, М .; Li, J .; Chapman, A.R .; Zhu, P .; Ху, X .; Xu, L .; Ян, Л .; Bai, F .; Qiao, J .; Tang, F .; Li, R .; Се, С. (2012). «Исследование мейотической рекомбинации и анеуплоидии отдельных сперматозоидов путем секвенирования всего генома». Наука 338, 1627. DOI: 10.1126 / science.1229112. PMID  23258895
  7. ^ а б Реуэлл, П. (2013). «Одна клетка - это все, что вам нужно - инновационная технология позволяет секвенировать весь геном из одной клетки». Harvard Gazette. http://news.harvard.edu/gazette/story/2013/01/one-cell-is-all-you-need/
  8. ^ а б Miller, C.R .; Joyce, P .; Уэйтс, Л.П. (2002). «Оценка выпадения аллелей и надежности генотипа с использованием максимального правдоподобия». Генетика 160 (1) 357-366. PMID  11805071