Амплификация рекомбиназной полимеразы - Recombinase polymerase amplification

Амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) - это одинарная трубка, изотермическая альтернатива полимеразной цепной реакции (ПЦР).[1] Добавив обратная транскриптаза фермент к реакции RPA, которую он может обнаружить РНК а также ДНК, без необходимости отдельного шага для производства кДНК,.[2][3][4] Потому что это так изотермический, RPA может использовать гораздо более простое оборудование, чем PCR, которое требует термоциклер. Лучше всего работать при температурах 37–42 ° C и все еще работать, хотя и медленнее, при комнатной температуре, что теоретически означает, что реакции RPA можно запустить быстро, просто удерживая пробирку. Это делает RPA отличным кандидатом для разработки недорогих, быстрых молекулярных тестов в месте оказания медицинской помощи. Международная оценка качества молекулярного обнаружения Вирус лихорадки Рифт-Валли выполняются так же, как и лучшие тесты RT-PCR, обнаруживая менее концентрированные образцы, пропущенные некоторыми тестами PCR и РТ-ЛАМПА тест.[5]RPA была разработана и запущена TwistDx Ltd. (ранее известной как ASM Scientific Ltd), биотехнологической компанией, базирующейся в Кембридже, Великобритания.

Техника

Процесс RPA включает три основных ферменты - а рекомбиназа, а одноцепочечный ДНК-связывающий белок (SSB) и вытесняющая прядь полимераза. Рекомбиназы способны образовывать пары олигонуклеотид праймеры с гомологичной последовательностью в дуплексной ДНК.[1] SSB связываются со смещенными цепями ДНК и предотвращают грунтовки от смещения. Наконец, начинается полимераза, вытесняющая нить. Синтез ДНК где праймер связался с целевой ДНК. Используя два противоположных праймера, подобно ПЦР, если целевая последовательность действительно присутствует, экспоненциальный Амплификация ДНК реакция инициируется. Никаких других манипуляций с образцом, таких как термическое или химическое плавление, не требуется для инициирования амплификации. При оптимальных температурах (37–42 ° C) реакция протекает быстро и приводит к специфической амплификации ДНК от нескольких копий-мишеней до обнаруживаемых уровней, обычно в течение 10 минут, для быстрого обнаружения вирусной геномной ДНК или РНК,[2][3][4][6][7][8] геномная ДНК патогенных бактерий,[9][10] а также короткую аптамерную ДНК.[11]

Три основных фермента RPA могут быть дополнены другими ферментами для обеспечения дополнительной функциональности. Добавление экзонуклеаза III позволяет использовать экзо-зонд для обнаружения флуоресценции в реальном времени, сродни ПЦР в реальном времени.[1] Добавление эндонуклеаза IV означает, что зонд nfo может использоваться для обнаружение полосы бокового потока успешного усиления.[1][6][12] Если добавить обратную транскриптазу, работающую при 37–42 ° C, то РНК может быть подвергнута обратной транскрипции, а полученная кДНК амплифицирована за один шаг. В настоящее время доступна только exo-версия RPA TwistAmp с включенной обратной транскриптазой, хотя пользователи могут просто дополнить другие реакции TwistAmp обратной транскриптазой для получения того же эффекта. Как и в случае с ПЦР, все формы реакций RPA могут быть мультиплексированный путем добавления дополнительных пар праймер / зонд, что позволяет обнаруживать несколько аналитов или внутренний контроль в одной и той же пробирке.

Связь с другими методами усиления

RPA - один из нескольких методов изотермической амплификации нуклеиновых кислот, который будет разработан в качестве метода молекулярной диагностики, часто с целью упрощения лабораторного оборудования, необходимого по сравнению с ПЦР. Неполный список других методов изотермического усиления включает: НАПОЛЬНАЯ ЛАМПА, НАСБА, зависимая от геликазы амплификация (HDA) и реакция амплификации никелирующего фермента (ВОЗЛЕ). Методы различаются особенностями конструкции праймеров и механизма реакции, и в некоторых случаях (например, RPA) используют коктейли из двух или более ферментов. Как и RPA, многие из этих методов предлагают быстрое время амплификации с возможностью упрощения инструментов и сообщают о резистентности к веществам в неочищенных образцах, которые, как известно, ингибируют ПЦР. Что касается времени амплификации, современные термоциклеры с быстрым изменением температуры могут сократить время амплификации ПЦР до менее 30 минут, особенно для коротких ампликонов с использованием двухтемпературного цикла, а не традиционных трехтемпературных протоколов.[13] Кроме того, требования к пробоподготовке (включая лизис и выделение ДНК или РНК, если необходимо) следует рассматривать как часть общего времени и сложности, присущих методике. Эти требования различаются в зависимости от метода, а также от конкретной цели и типа образца.

По сравнению с ПЦР, рекомендации по конструированию праймеров и зондов для RPA менее известны и могут потребовать определенной степени проб и ошибок, хотя недавние результаты показывают, что стандартные праймеры для ПЦР также могут работать.[14] Общий принцип дискретного ампликона, ограниченного прямым и обратным праймером с (необязательным) внутренним флуорогенным зондом, аналогичен ПЦР. Праймеры для ПЦР можно использовать непосредственно в RPA, но их короткая длина означает, что скорость рекомбинации низкая, а RPA не будет особенно чувствительным или быстрым. Обычно для эффективного образования рекомбиназных филаментов и эффективности RPA необходимы праймеры из 30–38 оснований. Это контрастирует с некоторыми другими методами, такими как LAMP, которые используют большее количество праймеров с учетом дополнительных конструктивных ограничений. Хотя в исходном отчете RPA за 2006 г. описан функциональный набор компонентов реакции, текущая (запатентованная) формулировка набора TwistAmp «существенно отличается» [15] и доступен только у поставщика TwistDx. Это по сравнению с реакционными смесями для ПЦР которые доступны у многих поставщиков, или НАПОЛЬНАЯ ЛАМПА или же НАСБА для которых состав реакционной смеси публикуется бесплатно, что позволяет исследователям создавать свои собственные индивидуальные «наборы» из недорогих ингредиентов.

В опубликованной научной литературе, как правило, отсутствует подробное сравнение эффективности методов изотермической амплификации, таких как RPA, HDA и LAMP, относительно друг друга, часто сравнивая один изотермический метод с «золотым стандартом» ПЦР-анализа. Это затрудняет оценку достоинств этих методов независимо от заявлений производителей, изобретателей или сторонников. Кроме того, характеристики производительности любого метода амплификации трудно отделить от дизайна праймера: «хороший» набор праймеров для одной мишени для RPA может дать более быструю амплификацию или более чувствительное обнаружение, чем «плохой» набор праймеров LAMP для той же цели, но обратное может быть верным для разных наборов праймеров для другой мишени. Исключением является недавнее исследование, в котором сравниваются RT-qPCR, RT-LAMP и RPA для обнаружения вируса Шмалленберга и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота.[16] что эффективно указывает на то, что каждый метод усиления имеет сильные и слабые стороны, которые могут варьироваться в зависимости от цели, и что свойства доступных методов усиления необходимо оценивать в сочетании с требованиями для каждого приложения. Как и в случае с ПЦР и любым другим методом амплификации, очевидно, что существует систематическая ошибка публикации, поскольку неэффективные наборы праймеров редко считаются достойными публикации.

Рекомендации

  1. ^ а б c d Пипенбург, Олаф; Уильямс, Колин Х .; Стемпл, Дерек Л .; Армс, Найл А. (2006). «Обнаружение ДНК с использованием рекомбинационных белков». PLOS Биология. 4 (7): e204. Дои:10.1371 / journal.pbio.0040204. ЧВК  1475771. PMID  16756388.
  2. ^ а б Эйлер, Милена; Ван, Юнцзе; Нентвич, Оливер; Пипенбург, Олаф; Hufert, Frank T .; Вайдманн, Манфред (2012). «Анализ амплификации рекомбиназной полимеразы для быстрого обнаружения вируса лихорадки долины Рифт». Журнал клинической вирусологии. 54 (4): 308–12. Дои:10.1016 / j.jcv.2012.05.006. PMID  22683006.
  3. ^ а б Amer, H.M .; Abd El Wahed, A .; Shalaby, M.A .; Almajhdi, F.N .; Hufert, F.T .; Вайдманн, М. (2013). «Новый подход к диагностике коронавируса крупного рогатого скота с использованием анализа амплификации полимеразы рекомбиназы с обратной транскрипцией». Журнал вирусологических методов. 193 (2): 337–40. Дои:10.1016 / j.jviromet.2013.06.027. ЧВК  7113639. PMID  23811231.
  4. ^ а б Абд Эль Вахед, Ахмед; Эль-Диб, Айман; Эль-Толот, Мохамед; Абд Эль Кадер, Хана; Ахмед, Абир; Хасан, Сайед; Хоффманн, Бернд; Хаас, Бернд; Shalaby, Mohamed A .; Hufert, Frank T .; Вайдманн, Манфред (2013). Мэн, Сян-Цзинь (ред.). "Портативный анализ амплификации рекомбиназной полимеразы с обратной транскрипцией для быстрого обнаружения вируса ящура". PLOS ONE. 8 (8): e71642. Bibcode:2013PLoSO ... 871642A. Дои:10.1371 / journal.pone.0071642. ЧВК  3748043. PMID  23977101.
  5. ^ Эскадафаль, Камилла; Paweska, Janusz T .; Гроббелаар, Антуанетта; Ле Ру, Шантель; Булой, Мишель; Патель, Пранав; Тайхманн, Анетт; Доносо-Мантке, Оливер; Нидриг, Маттиас (2013). Де Сильва, Аравинда М (ред.). «Международная внешняя оценка качества молекулярного обнаружения вируса лихорадки Рифт-Валли». PLOS забытые тропические болезни. 7 (5): e2244. Дои:10.1371 / journal.pntd.0002244. ЧВК  3662703. PMID  23717706.
  6. ^ а б Бойл, Д. С .; Lehman, D. A .; Lillis, L .; Peterson, D .; Singhal, M .; Armes, N .; Паркер, М .; Piepenburg, O .; Овербо, Дж. (2013). «Быстрое обнаружение провирусной ДНК ВИЧ-1 для ранней диагностики младенцев с помощью амплификации рекомбиназной полимеразы». мБио. 4 (2): e00135–13. Дои:10.1128 / mBio.00135-13. ЧВК  3622927. PMID  23549916.
  7. ^ Эйлер, М .; Wang, Y .; Отто, П .; Tomaso, H .; Escudero, R .; Anda, P .; Hufert, F.T .; Вайдманн, М. (2012). «Анализ амплификации рекомбиназной полимеразы для быстрого обнаружения Francisella tularensis». Журнал клинической микробиологии. 50 (7): 2234–8. Дои:10.1128 / JCM.06504-11. ЧВК  3405570. PMID  22518861.
  8. ^ Эйлер, М .; Wang, Y .; Heidenreich, D .; Patel, P .; Strohmeier, O .; Hakenberg, S .; Niedrig, M .; Hufert, F.T .; Вайдманн, М. (2013). «Разработка панели анализов амплификации рекомбиназной полимеразы для обнаружения биологически опасных агентов». Журнал клинической микробиологии. 51 (4): 1110–7. Дои:10.1128 / JCM.02704-12. ЧВК  3666764. PMID  23345286.
  9. ^ Себастьян К., Валентина Р., Франк Ф. Б., Маркус фон Н. Р. (2014). «Мультиплексная изотермическая твердофазная рекомбиназная полимеразная амплификация для специфического и быстрого обнаружения трех бактериальных патогенов на основе ДНК». Microchimica Acta. 181 (13–14): 1715–1723. Дои:10.1007 / s00604-014-1198-5. ЧВК  4167443. PMID  25253912.
  10. ^ Сантьяго-Фелипе С., Тортахада-Хенаро Л.А., Мораис С., Пучадес Р., Макиейра Á (2015). «Стратегии изотермической амплификации ДНК для обнаружения дуплексных микроорганизмов». Food Chem. 174: 509–515. Дои:10.1016 / j.foodchem.2014.11.080. HDL:10251/66087. PMID  25529713.
  11. ^ Лу Дж. Ф., Лау П. М., Хо ХП, Конг СК (2013). «Анализ биострих-кода на основе аптамера с амплификацией изотермической рекомбиназной полимеразы для обнаружения цитохрома-с и скрининга противораковых лекарств». Таланта. 115: 159–165. Дои:10.1016 / j.talanta.2013.04.051. PMID  24054573.
  12. ^ Rohrman, Brittany A .; Ричардс-Кортум, Ребекка Р. (2012). «Устройство из бумаги и пластика для выполнения рекомбиназной полимеразы амплификации ДНК ВИЧ». Лаборатория на чипе. 12 (17): 3082–8. Дои:10.1039 / c2lc40423k. ЧВК  3569001. PMID  22733333.
  13. ^ «Быстрая ПЦР». Dna.utah.edu. Получено 2014-06-21.
  14. ^ «Праймеры для ПЦР работают с использованием стандартных реагентов RPA». TwistDx. Получено 2015-10-19.[постоянная мертвая ссылка ]
  15. ^ «Публикации». TwistDx. Получено 2014-06-21.
  16. ^ Эбишер, Андреа (2014). «Быстрое определение генома вируса Шмалленберга и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота с использованием методов изотермической амплификации и высокоскоростной ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени». Журнал клинической микробиологии. 52 (6): 1883–92. Дои:10.1128 / JCM.00167-14. ЧВК  4042763. PMID  24648561.