Олигонуклеотид - Oligonucleotide

Олигонуклеотиды короткие ДНК или РНК молекулы олигомеры, которые имеют широкий спектр применения в генетическое тестирование, исследование, и криминалистика. Обычно производится в лаборатории твердофазный химический синтез,[1] эти небольшие кусочки нуклеиновых кислот могут быть изготовлены как одноцепочечные молекулы с любой заданной пользователем последовательностью, и поэтому они жизненно важны для искусственный синтез генов, полимеразной цепной реакции (ПЦР), Секвенирование ДНК, молекулярное клонирование и, как молекулярные зонды. В природе олигонуклеотиды обычно встречаются в виде небольших молекул РНК, которые функционируют в регуляции экспрессии генов (например, микроРНК ), или являются промежуточными продуктами разложения, полученными в результате разрушения более крупных молекул нуклеиновой кислоты.

Олигонуклеотиды характеризуются последовательность из нуклеотид остатки, составляющие всю молекулу. Длина олигонуклеотида обычно обозначается "-мер " (из Греческий мерос, "часть"). Например, олигонуклеотид из шести нуклеотидов (нуклеотидов) является гексамером, а один из 25 нуклеотидов обычно называют «25-мерным». Олигонуклеотиды легко связываются специфическим для последовательности образом со своими соответствующими дополнительный олигонуклеотиды, ДНК или РНК с образованием дуплексы или, реже, гибриды более высокого порядка. Это основное свойство служит основой для использования олигонуклеотидов в качестве зонды для обнаружения специфических последовательностей ДНК или РНК. Примеры процедур, в которых используются олигонуклеотиды, включают: ДНК-микрочипы, Саузерн-блоты, ASO анализ, флуоресцентная гибридизация in situ (РЫБЫ), ПЦР, и синтез искусственных генов.

Олигонуклеотиды состоят из 2'-дезоксирибонуклеотиды (олигодезоксирибонуклеотиды), которые можно модифицировать в основной цепи или в положении 2 ’сахара для достижения различных фармакологических эффектов. Эти модификации придают олигонуклеотидам новые свойства и делают их ключевым элементом антисмысловая терапия.[2][3]

Синтез

Основная статья: синтез олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды химически синтезируются с использованием строительных блоков, защищенных фосфорамидиты натурального или химически модифицированного нуклеозиды или, в меньшей степени, ненуклеозидных соединений. Сборка олигонуклеотидной цепи происходит в направлении от 3 'до 5', следуя стандартной процедуре, называемой «синтетическим циклом». Завершение единственного цикла синтеза приводит к добавлению одного нуклеотидного остатка к растущей цепи. Выход менее 100% на каждой стадии синтеза и наличие побочных реакций устанавливают практические пределы эффективности процесса. Как правило, олигонуклеотидные последовательности обычно короткие (13-25 нуклеотидов).[4] Максимальная длина синтетических олигонуклеотидов едва превышает 200 нуклеотидных остатков. ВЭЖХ и другие методы могут использоваться для выделения продуктов с желаемой последовательностью.

Химические модификации

Создание химически стабильных коротких олигонуклеотидов было самой ранней проблемой при разработке методов лечения ASO. Встречающиеся в природе олигонуклеотиды легко разрушаются нуклеазами - ферментом, который расщепляет нуклеотиды и присутствует в клетках любого типа.[5] Короткие олигонуклеотидные последовательности также обладают слабой внутренней аффинностью связывания, что способствует их деградации in vivo.[6]

Модификации магистрали

Нуклеозид органотиофосфат (PS) аналоги нуклеотидов придают олигонуклеотидам некоторые полезные свойства. Основные полезные свойства нуклеотидов, которые придают скелеты PS: диастереомер идентификация каждого нуклеотида и способность легко отслеживать реакции с участием фосфоротиоатных нуклеотидов, что полезно при синтезе олигонуклеотидов.[7] Модификации скелета PS олигонуклеотидов защищают их от нежелательной деградации ферментами.[8] Модификация нуклеотидного остова широко используется, потому что это может быть достигнуто с относительной легкостью и точностью для большинства нуклеотидов.[7]

Модификации сахарного кольца

Другая модификация, полезная для медицинского применения олигонуклеотидов, - это 2 ’сахарные модификации. Модификация сахара в положении 2 ’увеличивает эффективность олигонуклеотидов за счет увеличения способности олигонуклеотидов к целевому связыванию, особенно в терапия антисмысловыми олигонуклеотидами.[6] Они также уменьшают неспецифическое связывание с белками, повышая точность нацеливания на конкретные белки.[6] Две наиболее часто используемые модификации - это 2’-O-метил и 2’-O-метоксиэтил.[6]

Антисмысловые олигонуклеотиды

Основная статья: Антисмысловая терапия

Антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой одиночные цепи ДНК или РНК, комплементарные выбранной последовательности.[4] На случай, если антисмысловая РНК они предотвращают трансляция белков определенных информационная РНК пряди путем связывания с ними в процессе, называемом гибридизация.[9] Антисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для нацеливания на конкретный, комплементарный (кодирующий или некодирование ) РНК. Если происходит связывание, этот гибрид может быть разрушен ферментом РНКаза H.[9] РНКаза H - это фермент, который гидролизует РНК, и при использовании в антисмысловых олигонуклеотидах приводит к снижению экспрессии мРНК на 80-95%.[4]

Использование Морфолино антисмысловые олигонуклеотиды для нокдауна генов в позвоночные, что сейчас является стандартной техникой в биология развития и используется для изучения измененных экспрессия гена и функции генов, была впервые разработана Джанет Хисман с использованием Xenopus.[10] Утвержденные FDA препараты морфолино включают: Eteplirsen и голодирсен. Антисмысловые олигонуклеотиды также использовались для ингибирования репликации вируса гриппа в клеточных линиях.[11][12]

Нейродегенеративные заболевания, возникающие в результате действия одного мутантного белка, являются хорошими мишенями для терапии антисмысловыми олигонуклеотидами из-за их способности воздействовать на очень специфические последовательности РНК и изменять их с высокой селективностью. Многие генетические заболевания, включая болезнь Хантингтона, Болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, и боковой амиотрофический склероз (БАС) были связаны с изменениями ДНК, которые приводят к неправильным последовательностям РНК и неправильному переводу белков, оказывающих токсический физиологический эффект.[13]

Аналитические методы

Хроматография

Алкиламиды может использоваться как хроматографический стационарные фазы.[14] Эти фазы были исследованы на предмет разделения олигонуклеотидов.[15]

Масс-спектрометрии

Смесь 5-метоксисалициловая кислота и спермин может использоваться в качестве матрицы для анализа олигонуклеотидов в МАЛДИ масс-спектрометрии.[16]

Микрочип ДНК

ДНК-микрочипы - полезное аналитическое применение олигонуклеотидов. По сравнению со стандартным кДНК микрочипы, микроматрицы на основе олигонуклеотидов обладают более контролируемой специфичностью по сравнению с гибридизацией и способностью измерять присутствие и распространенность альтернативно сплайсированных или полиаденилированный последовательности.[17] Один подтип ДНК-микрочипов можно описать как субстраты (нейлон, стекло и т. Д.), С которыми олигонуклеотиды связаны с высокой плотностью.[18] Есть ряд применение микрочипов ДНК в области наук о жизни.

Смотрите также

  • Аптамеры, олигонуклеотиды с важными биологическими применениями
  • Морфолинос олигонуклеотиды с неприродным остовом, которые не активируют РНКазу-H, но могут снижать экспрессию генов или изменять сплайсинг РНК
  • Полиморфизм, появление в популяции одного и того же гена в нескольких формах из-за мутаций; часто можно протестировать с помощью зондов ASO
  • CpG Олигодезоксинуклеотид, ODN с иммуностимулирующими свойствами
  • Полипуриновые шпильки обратного Хугстина, PPRH, олигонуклеотиды, которые могут связывать ДНК или РНК и снижать экспрессию генов.

Рекомендации

  1. ^ Ян Дж., Столи Дж. А., Цзян Х., Сяо Л., Кисман В. Ф., Антиа Ф. Д. и др. (Октябрь 2018 г.). «Твердофазный синтез фосфоротиоатных олигонуклеотидов с использованием побочных продуктов серы для улавливания in situ». Журнал органической химии. 83 (19): 11577–11585. Дои:10.1021 / acs.joc.8b01553. PMID  30179468.
  2. ^ Вайс, Б., изд. (1997). Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды и антисмысловые РНК: новые фармакологические и терапевтические агенты. Бока-Ратон, Флорида: CRC Press
  3. ^ Вайс Б., Давидкова Г., Чжоу Л.В. (1999). «Генная терапия антисмысловой РНК для изучения и модуляции биологических процессов». Клеточные и молекулярные науки о жизни. 55 (3): 334–58. Дои:10.1007 / с000180050296. PMID  10228554.
  4. ^ а б c Диас Н., Стейн CA (март 2002 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: основные понятия и механизмы». Молекулярная терапия рака. 1 (5): 347–55. PMID  12489851.
  5. ^ Фрейзер К.С. (январь 2015 г.). "Антисмысловые олигонуклеотидные терапии: перспективы и проблемы с точки зрения токсикологического патолога". Токсикологическая патология. 43 (1): 78–89. Дои:10.1177/0192623314551840. PMID  25385330.
  6. ^ а б c d DeVos SL, Miller TM (июль 2013 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: лечение нейродегенерации на уровне РНК». Нейротерапия. 10 (3): 486–97. Дои:10.1007 / s13311-013-0194-5. ЧВК  3701770. PMID  23686823.
  7. ^ а б Экштейн Ф (апрель 2000 г.). «Фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды: каково их происхождение и в чем их уникальность?». Разработка антисмысловых и нуклеиновых кислот. 10 (2): 117–21. Дои:10.1089 / oli.1.2000.10.117. PMID  10805163.
  8. ^ Штейн К.А., Субасингхе С., Шинозука К., Коэн Дж. С. (апрель 1988 г.). «Физико-химические свойства фосфоротиоатных олигодезоксинуклеотидов». Исследования нуклеиновых кислот. 16 (8): 3209–21. Дои:10.1093 / nar / 16.8.3209. ЧВК  336489. PMID  2836790.
  9. ^ а б Crooke ST (апрель 2017 г.). «Молекулярные механизмы антисмысловых олигонуклеотидов». Нуклеиновые кислоты. 27 (2): 70–77. Дои:10.1089 / нат.2016.0656. ЧВК  5372764. PMID  28080221.
  10. ^ Хисман Дж, Кофрон М, Уайли С. (июнь 2000 г.). «Активность передачи сигналов бета-катенина в раннем эмбрионе Xenopus: новый антисмысловой подход». Биология развития. 222 (1): 124–34. Дои:10.1006 / dbio.2000.9720. PMID  10885751.
  11. ^ Кумар П., Кумар Б., Раджпут Р., Саксена Л., Банерджа А.С., Кханна М. (ноябрь 2013 г.). «Перекрестный защитный эффект антисмыслового олигонуклеотида, разработанный против обычного 3 'NCR генома вируса гриппа A». Молекулярная биотехнология. 55 (3): 203–11. Дои:10.1007 / s12033-013-9670-8. PMID  23729285.
  12. ^ Кумар Б., Кханна М., Кумар П., Суд В., Вьяс Р., Банерджа А.С. (май 2012 г.). «Опосредованное нуклеиновой кислотой расщепление гена M1 вируса гриппа A значительно усиливается антисмысловыми молекулами, нацеленными на гибридизацию вблизи сайта расщепления». Молекулярная биотехнология. 51 (1): 27–36. Дои:10.1007 / s12033-011-9437-z. PMID  21744034.
  13. ^ Смит Р.А., Миллер Т.М., Яманака К., Мония Б.П., Кондон Т.П., Хунг Г. и др. (Август 2006 г.). «Антисмысловая олигонуклеотидная терапия нейродегенеративного заболевания». Журнал клинических исследований. 116 (8): 2290–6. Дои:10.1172 / JCI25424. ЧВК  1518790. PMID  16878173.
  14. ^ Бушевский Б., Кастури П., Гилпин Р.К., Гангода М.Э., Яронец М. (август 1994 г.). «Хроматографические и родственные исследования алкиламидных фаз». Хроматография. 39 (3–4): 155–61. Дои:10.1007 / BF02274494.
  15. ^ Buszewski B, Safaei Z, Studzińska S (январь 2015 г.). «Анализ олигонуклеотидов методом жидкостной хроматографии с неподвижной фазой алкиламида». Открытая химия. 13 (1). Дои:10.1515 / chem-2015-0141.
  16. ^ Дистлер AM, Эллисон Дж (апрель 2001 г.). «5-Метоксисалициловая кислота и спермин: новая матрица для матричного масс-спектрометрического анализа олигонуклеотидов с лазерной десорбцией / ионизацией». Журнал Американского общества масс-спектрометрии. 12 (4): 456–62. Дои:10.1016 / S1044-0305 (01) 00212-4. PMID  11322192.
  17. ^ Relógio A, Schwager C, Richter A, Ansorge W, Valcárcel J (июнь 2002 г.). «Оптимизация микрочипов ДНК на основе олигонуклеотидов». Исследования нуклеиновых кислот. 30 (11): e51. Дои:10.1093 / nar / 30.11.e51. ЧВК  117213. PMID  12034852.
  18. ^ Гонг П., Harbers GM, Grainger DW (апрель 2006 г.). «Сравнение нескольких методов поверхностной плотности иммобилизованных и гибридизированных олигонуклеотидов на предметных стеклах коммерческих амино-реактивных микрочипов». Аналитическая химия. 78 (7): 2342–51. Дои:10.1021 / ac051812m. PMID  16579618.

дальнейшее чтение

  • Спинглер Б (январь 2012 г.). «Глава 3. Конформационные изменения олигонуклеотидов, стимулированные ионами металлов». В Sigel A, Sigel H, Sigel RK (ред.). Взаимодействие между ионами металлов и нуклеиновыми кислотами. 10. Springer Science & Business Media. С. 103–118. Дои:10.1007/978-94-007-2172-2_3.

внешняя ссылка