Синтетический генетический массив - Synthetic genetic array

Анализ синтетического генетического массива (SGA) это высокая пропускная способность техника для исследования синтетический смертельный и синтетические больные генетические взаимодействия (SSL ).[1] SGA позволяет систематически создавать двойные мутанты с использованием комбинации рекомбинантные генетические методы, этапы вязки и отбора. Используя методологию SGA, мутант с делецией запрашиваемого гена может быть скрещен со всем набором делеций генома для идентификации любого SSL взаимодействия, что дает функциональную информацию о гене запроса и генах, с которыми он взаимодействует. Крупномасштабное применение SGA, в котором ~ 130 генов запроса были скрещены с набором ~ 5000 жизнеспособных делеционных мутантов в дрожжах, выявило генетическую сеть, содержащую ~ 1000 генов и ~ 4000 взаимодействий SSL.[2] Результаты этого исследования показали, что гены со схожими функциями имеют тенденцию взаимодействовать друг с другом, а гены со схожими паттернами генетических взаимодействий часто кодируют продукты, которые, как правило, работают в одном и том же пути или в комплексе. Анализ синтетического генетического массива изначально был разработан с использованием модельного организма. С. cerevisiae. С тех пор этот метод был расширен, чтобы охватить 30% С. cerevisiae геном.[3] С тех пор была разработана методология, позволяющая проводить анализ SGA в S.pombe[4][5] и Кишечная палочка.[6][7]

Массив дрожжей показывает синтетические летальные взаимодействия. Синтетические летальные взаимодействия - это пары колоний со сниженным ростом или без него.

Фон

Синтетический анализ генетического массива был первоначально разработан Тонгом и соавт.[1] в 2001 году и с тех пор используется многими группами, работающими в широком спектре биомедицинских областей. SGA использует весь набор нокаутов генома дрожжей, созданный проектом делеции генома дрожжей.[8]

Процедура

Синтетический генетический анализ массивов обычно проводится с использованием массивов колоний на чашках Петри при стандартной плотности (96, 384, 768, 1536). Чтобы выполнить анализ SGA в S.cerevisae, делеция гена запроса систематически пересекается с массивом делеционных мутантов (DMA), содержащим все жизнеспособные нокауты ORF генома дрожжей (в настоящее время 4786 штаммов).[9] Результирующий диплоиды затем спорулируют путем переноса в среду, содержащую восстановленный азот. В гаплоидный потомство затем подвергается серии селекционных посевов и инкубаций для отбора двойных мутантов. Двойные мутанты проверяются на SSL-взаимодействия визуально или с использованием программного обеспечения для визуализации, оценивая размер полученных колоний.

Репликация дрожжевых колоний во время анализа SGA с помощью пиннинг-робота

Робототехника

Из-за большого количества точных шагов репликации в анализе SGA, роботы широко используются для выполнения манипуляций с колониями. Существует несколько систем, специально разработанных для анализа SGA, которые значительно сокращают время анализа запрашиваемого гена. Как правило, они имеют ряд штифтов, которые используются для переноса клеток на планшеты и обратно, а в одной системе используются одноразовые подушечки штифтов для исключения циклов стирки. Компьютерные программы можно использовать для анализа размеров колоний по изображениям чашек, тем самым автоматизируя оценку SGA и химико-генетическое профилирование.

Шаг к созданию системы генетического скрининга дрожжей с высоким содержанием генома (дорожная карта SGA)

Есть шесть основных компонентов

  1. Коллекция мутантов
  2. Материал и инструменты для работы с мутантами
  3. Система анализа изображений
  4. Автоматическая система количественной оценки и оценки
  5. Подтверждение подходов
  6. Инструменты анализа данных
  • Коллекция мутантов

Первым шагом является сбор мутантов и создание библиотеки мутантов в твердой или жидкой среде. Твердые носители могут быть лучше, потому что они могут сэкономить много времени. На ранней стадии создание мутанта было выполнено методом гомологичной рекомбинации. У нас есть отличная библиотека мутантов для Saccharomyces cerevisiae, хорошо изученный модельный организм.

Однако, если вы пытаетесь создать новую модель дрожжей, вам может потребоваться секвенирование генома и прогнозирование возможной ORF с помощью хорошего эталонного генома дрожжей (например, с Saccharomyces cerevisiae). Рассмотрим особый случай: если у вас нет эталонного генома, вам следует выбрать транскриптом и анализ генома этого нового модельного организма.

  • Материал и инструменты для работы с мутантами
    Как только у вас будет ваша библиотека мутантов на твердом носителе. Если мутанты находятся в твердой среде, мы расположили мутанты в соотношении 1: 3, то есть от одного массива мутантов дикого типа до трех (почему? Дикий тип работает как внутренний контроль, а в твердой среде питательные вещества не должны распределяться поровну, чтобы избежать предвзятость). После того, как у вас есть мутанты с удаленным одним геном, вы можете запустить инструменты для работы с мутантами. В SGA это называется «закрепление». Версии ROTOR-HAD (называемые роботами-закрепителями), используемые для закрепления мутантов дрожжей. На этой машине установлен удобный интерфейс, который помогает прикреплять образцы с исходных пластин к экспериментальным пластинам.
  1. Система анализа изображений
  2. Автоматическая система количественной оценки и оценки
  3. Подтверждение подходов
  4. Инструменты анализа данных

Коллекция мутантов

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Тонг, А. Х. Й .; Евангелиста, М .; Parsons, A.B .; Xu, H .; Bader, G.D .; Pagé, N .; Робинсон, М .; Raghibizadeh, S .; Hogue, C.W .; Bussey, H .; Эндрюс, B .; Tyers, M .; Бун, К. (2001). «Систематический генетический анализ с упорядоченными массивами мутантов делеции дрожжей». Наука. 294 (5550): 2364–2368. Дои:10.1126 / science.1065810. PMID  11743205.
  2. ^ Тонг, А. Х. Й .; Lesage, G .; Bader, G.D .; Ding, H .; Xu, H .; Xin, X .; Young, J .; Berriz, G.F .; Brost, R.L .; Chang, M .; Chen, Y .; Cheng, X .; Chua, G .; Friesen, H .; Голдберг, Д. С .; Haynes, J .; Humphries, C .; Он, G .; Hussein, S .; Ke, L .; Krogan, N .; Ли, З .; Levinson, J. N .; Lu, H .; Ménard, P .; Munyana, C .; Parsons, A.B .; Ryan, O .; Тоникян, Р .; Робертс, Т. (2004). «Глобальное картирование сети генетического взаимодействия дрожжей». Наука. 303 (5659): 808–813. Дои:10.1126 / science.1091317. PMID  14764870.
  3. ^ Костанцо, М .; Барышникова, А .; Bellay, J .; Kim, Y .; Spear, E.D .; Sevier, C. S .; Ding, H .; Koh, J. L. Y .; Toufighi, K .; Мостафави, С .; Prinz, J .; St Onge, R.P .; Vandersluis, B .; Махневич, Т .; Vizeacoumar, F.J .; Ализаде, С .; Bahr, S .; Brost, R.L .; Chen, Y .; Cokol, M .; Deshpande, R .; Ли, З .; Lin, Z. -Y .; Liang, W .; Марбак, М .; Paw, J .; Сан-Луис, Б. -Дж .; Shuteriqi, E .; Тонг, А. Х. Й .; Ван Дайк, Н. (2010). «Генетический ландшафт клетки». Наука. 327 (5964): 425–431. Дои:10.1126 / наука.1180823. ЧВК  5600254. PMID  20093466.
  4. ^ Рогуев А .; Wiren, M .; Weissman, J. S .; Кроган, Н. Дж. (2007). «Высокопроизводительное картирование генетического взаимодействия в делящихся дрожжах Schizosaccharomyces pombe». Методы природы. 4 (10): 861–866. Дои:10.1038 / nmeth1098. PMID  17893680.
  5. ^ Диксон, С. Дж .; Федишин, Ю .; Koh, J. L. Y .; Prasad, T. S. K .; Chahwan, C .; Chua, G .; Toufighi, K .; Барышникова, А .; Hayles, J .; Hoe, K. -L .; Kim, D. -U .; Парк, Х. -О .; Myers, C.L .; Pandey, A .; Durocher, D .; Andrews, B.J .; Бун, К. (2008). «Значительное сохранение синтетических сетей летального генетического взаимодействия между отдаленно родственными эукариотами». Труды Национальной академии наук. 105 (43): 16653–16658. Дои:10.1073 / pnas.0806261105. ЧВК  2575475. PMID  18931302.
  6. ^ Typas, A .; Nichols, R.J .; Siegele, D. A .; Сланцы, М .; Collins, S. R .; Lim, B .; Braberg, H .; Yamamoto, N .; Takeuchi, R .; Wanner, B.L .; Mori, H .; Weissman, J. S .; Krogan, N.J .; Гросс, К. А. (2008). «Высокопроизводительный количественный анализ генетических взаимодействий E. Coli». Методы природы. 5 (9): 781–787. Дои:10.1038 / nmeth.1240. ЧВК  2700713. PMID  19160513.
  7. ^ Butland, G .; Бабу, М .; Díaz-Mejía, J. J .; Богдана, Ф .; Phanse, S .; Золото, B .; Yang, W .; Li, J .; Гагаринова, А.Г .; Pogoutse, O .; Mori, H .; Wanner, B.L .; Lo, H .; Васневски, Дж .; Christopolous, C .; Али, М .; Venn, P .; Safavi-Naini, A .; Кислый, N .; Caron, S .; Choi, J. Y .; Laigle, L .; Назарян-Армавил, А .; Deshpande, A .; Joe, S .; Даценко, К. А .; Yamamoto, N .; Andrews, B.J .; Boone, C .; Дин, Х. (2008). «ESGA: анализ синтетического генетического массива E. Coli». Методы природы. 5 (9): 789–795. Дои:10.1038 / nmeth.1239. PMID  18677321.
  8. ^ "Сахаромицеты Проект удаления генома ".
  9. ^ «Нокаутные штаммы дрожжей». Открытые биосистемы. Архивировано из оригинал 19 ноября 2011 г.