Когерентная микроскопия комбинационного рассеяния света - Coherent Raman scattering microscopy

Одновременная двухцветная визуализация z-стека стимулированного комбинационного рассеяния без меток уха мыши (красный: белок, зеленый: липид, изображение 220 на 220 микрон, общая глубина 60 микрон, время задержки пикселя 2 микросекунды).

Когерентное комбинационное рассеяние света (CRS) микроскопия - это метод многофотонной микроскопии, основанный на Раман -активный колебательные моды молекул. Двумя основными методами микроскопии CRS являются: вынужденное комбинационное рассеяние света (ВКР) и когерентное антистоксово комбинационное рассеяние света (КАРС). SRS и CARS были теоретически предсказаны и экспериментально реализованы в 1960-х годах.^[1][2][3] В 1982 году был продемонстрирован первый микроскоп CARS.^[4] В 1999 году КАРС-микроскопия с использованием коллинеарной геометрии и высокого числовая апертура цель были разработаны в Сяолян Сунней Се лаборатория Гарвардского университета.^[5] Это продвижение сделало технику более совместимой с современными лазерные сканирующие микроскопы.^[6] С тех пор популярность CRS в биомедицинских исследованиях начала расти. CRS в основном используется для изображения липидов, белков и других биомолекул в живых или фиксированных клетках или тканях без маркировки или окрашивание.^[7] CRS также можно использовать для изображений образцов, помеченных рамановскими тегами,^[8][9][10] который может избежать помех от других молекул и обычно позволяет получать более сильные сигналы CRS, чем обычно получаемые для обычных биомолекул. CRS также находит применение в других областях, например в материаловедении.^[11] и экологическая наука.^[12]

Фон

Энергетические диаграммы процессов спонтанного и когерентного комбинационного рассеяния света.

Когерентное комбинационное рассеяние света основано на Рамановское рассеяние (или спонтанное комбинационное рассеяние света). В режиме спонтанного комбинационного рассеяния света используется только один лазер с монохроматическим возбуждением. Интенсивность сигнала спонтанного комбинационного рассеяния света линейно растет со средней мощностью лазер с непрерывной накачкой. В CRS,^[7] два лазера используются для возбуждения определенных колебательных мод молекул, которые необходимо отобразить. Лазер с более высокой энергией фотонов обычно называют лазером накачки, а лазер с более низкой энергией фотонов - стоксовым лазером. Чтобы произвести сигнал, их разность энергий фотонов должна соответствовать энергии колебательной моды:

${ displaystyle E_ {Raman} = E_ {насос} -E_ {Stokes}}$,

где ${ displaystyle E_ {Raman} = hbar Omega, E_ {pump} = hbar omega _ {pump}, E_ {Stokes} = hbar omega _ {Stokes}}$.

CRS - это нелинейно-оптический процесс, где уровень сигнала обычно является функцией произведения мощностей лазера накачки и стоксова лазера. Поэтому большинство экспериментов по микроскопии CRS проводится с импульсные лазеры, где более высокая пиковая мощность значительно улучшила уровни сигнала CRS.^[13]

Когерентная антистоксова рамановская микроскопия (КАРС) микроскопия

АВТОМОБИЛИ с прямым и эпи-обнаружением

В CARS антистоксовы фотоны (с более высокой энергией и меньшей длиной волны, чем у накачки) обнаруживаются как сигналы.

${ displaystyle E_ {CARS} = E_ {насос} + Omega = 2 times E_ {насос} -E_ {Stokes}}$

В CARS-микроскопии обычно есть два способа обнаружить вновь генерируемые фотоны. Один называется CARS с прямым обнаружением, другой - CARS с обнаружением эпи.^[14][15] В CARS с прямым детектированием генерируемые фотоны CARS вместе с лазером накачки и стоксовым лазером проходят через образец. Лазеры накачки и Стокса полностью блокируются высоким оптическая плотность (OD) режекторный фильтр. Фотоны CARS затем обнаруживаются фотоумножитель (PMT) или CCD камера. В обнаруживаемых эпи-детектированием CARS фотоны CARS, рассеянные обратно, перенаправляются дихроичное зеркало или же поляризационный светоделитель. После использования фильтров с высоким OD для блокировки обратно-рассеянных лазеров накачки и стоксовых лазеров вновь сгенерированные фотоны обнаруживаются с помощью ФЭУ. Интенсивность сигнала КАРС имеет следующую взаимосвязь с интенсивностями накачки и стоксова лазера ${ displaystyle I_ {pump}, I_ {Stokes}}$, количество молекул ${ displaystyle N}$ в фокусе лазеров и рамановской восприимчивости третьего порядка ${ displaystyle chi _ {Raman} ^ {(3)}}$ молекулы:^[16]

${ displaystyle I_ {CARS} propto (N chi _ {Raman} ^ {(3)}) ^ {2} I_ {pump} ^ {2} I_ {Stokes}}$

В соотношение сигнал шум (SNR), который является более важной характеристикой в ​​экспериментах по визуализации, зависит от квадратного корня из числа генерируемых фотонов CARS, которое приведено ниже:^[16]

${ displaystyle SNR_ {CARS} propto N chi _ {Raman} ^ {(3)} I_ {pump} { sqrt {I_ {Stokes}}}}$

Существуют и другие нелинейные оптические процессы, которые также генерируют фотоны на антистоксовой длине волны. Эти сигналы обычно называют нерезонансными (NR). четырехволновое смешение (FWM) фон в CARS микроскопии. Этот фон может вмешиваться с сигналом CARS конструктивно или деструктивно.^[17] Однако эту проблему можно частично обойти, вычитая резонансные и нерезонансные изображения.^[18][19] или используя математические методы для получения фоновых бесплатных изображений.^[20]

Микроскопия вынужденного комбинационного рассеяния света (ВКР)

В SRS интенсивность передачи энергии от длины волны накачки к длине волны стоксова лазера измеряется как сигнал. Есть два способа измерения сигналов SRS: один - измерить увеличение мощности стоксова лазера, которое называется усилением рамановского рассеяния (SRG). Другой - измерение уменьшения мощности лазера накачки, которое называется вынужденными рамановскими потерями (SRL). Поскольку смена власти составляет порядка 10⁻³ до 10⁻⁶ по сравнению с исходной мощностью лазеров накачки и Стокса, схема передачи модуляции^[21] обычно используется для извлечения сигналов SRS.^[22] Сигнал ВКР зависит от мощности лазера накачки и стоксова излучения следующим образом:

${ displaystyle I_ {SRS} propto N chi _ {Raman} ^ {(3)} I_ {pump} I_ {Stokes}}$

Дробовой шум Ограниченное обнаружение может быть достигнуто, если электронный шум от детекторов будет значительно ниже оптического, а лазерные дробовые помехи будут ограничены на частоте обнаружения (частоте модуляции). В случае ограниченного дробового шума отношение сигнал / шум (SNR) SRS^[16] является

${ displaystyle SNR_ {SRL} propto N chi _ {Raman} ^ {(3)} { sqrt {I_ {pump}}} I_ {Stokes}}$

${ displaystyle SNR_ {SRG} propto N chi _ {Raman} ^ {(3)} I_ {pump} { sqrt {I_ {Stokes}}}}$

Сигнал SRS свободен от нерезонансного фона, который мешает микроскопии CARS, хотя гораздо меньший нерезонансный фон от других оптических процессов (например, кросс-фазовая модуляция, многоцветный многофотонное поглощение ) может существовать.

SRS может быть обнаружен как в прямом, так и в эпи направлениях. При прямом обнаружении SRS модулированный лазер блокируется режекторным фильтром с высоким OD, а измерения другого лазера производятся с помощью фотодиода. Модуляция, передаваемая от модулированного лазера к исходному немодулированному лазеру, обычно извлекается синхронный усилитель с выхода фотодиода. В SRS с обнаружением эпи обычно существует два метода обнаружения сигнала SRS. Один из методов заключается в обнаружении света, рассеянного назад перед объективом, с помощью фотодиода с отверстием в центре. Другой метод аналогичен КАРС-микроскопии с обнаружением эпи, где обратно рассеянный свет проходит через объектив и отклоняется в сторону светового пути, как правило, с помощью комбинации поляризационного светоделителя и четвертьволновой пластинки. Затем стоксов лазер (или лазер накачки) обнаруживается после фильтрации накачки (или стоксов лазера).

Двухцветная, многоцветная и гиперспектральная микроскопия CRS

Одна пара длин волн лазера дает доступ только к одной частоте колебаний. Визуализация образцов с разными волновыми числами может обеспечить более конкретное и количественное химическое отображение образца.^{[23][24][25][26][27][28]} Это может быть достигнуто путем построения изображений с разными волновыми числами одно за другим. Эта операция всегда включает в себя какой-либо тип настройки: настройку одной из длин волн лазера, настройку устройства спектральной фильтрации или настройку временной задержки между лазером накачки и стоксовым лазером в случае спектрально-фокусирующего CRS. Другой способ выполнения многоцветной CRS - это использование одного пикосекундного лазера с узкой спектральной полосой (<1 нм) в качестве накачки или стоксова излучения и другого лазера с широкой спектральной полосой пропускания. В этом случае спектр передаваемого широкополосного лазера может быть расширен решеткой и измерен решеткой детекторов.

Спектрально-фокусирующий CRS

CRS обычно используют лазеры с узкополосными лазерами, ширина полосы которых <1 нм, для поддержания хорошего спектрального разрешения ~ 15 см.⁻¹. Лазеры с полосой пропускания менее 1 нм являются пикосекундными лазерами. В спектрально-фокусирующих ХРС фемтосекундные лазеры накачки и стоксовы лазеры одинаково линейны. щебетал в пикосекундные лазеры.^[29][30][31] Эффективная полоса пропускания становится меньше, и, следовательно, таким образом может быть достигнуто высокое спектральное разрешение с помощью фемтосекундных лазеров, которые обычно имеют широкую полосу пропускания. Регулировка волнового числа спектрально-фокусирующего CRS может быть достигнута как путем изменения центральной длины волны лазеров, так и путем изменения задержки между лазером накачки и стоксовым лазером.

Приложения

Когерентная рамановская гистология

Одним из основных приложений CRS является гистология без меток, которую также называют гистологией когерентного комбинационного рассеяния, или иногда гистологией стимулированного комбинационного рассеяния.^{[32][33][34][35]} В CRH изображения CRS получаются на изображениях липидов и белков и после некоторой обработки изображений изображение, подобное Окрашивание H&E может быть получен. В отличие от окрашивания H&E, CRH можно проводить на живых и свежих тканях и не требует фиксации или окрашивания.

Клеточный метаболизм

Метаболизм малых молекул, таких как глюкоза,^[36] холестерин,^[37] и наркотики^[38] исследуются с CRS в живых клетках. CRS обеспечивает способ измерения молекулярного распределения и количеств с относительно высокой производительностью.

Миелиновая визуализация

Миелин богат липидами. CRS обычно используется для визуализации миелина в живых или фиксированных тканях для исследования. нейродегенеративные заболевания или другие нервные расстройства.^[39][40][41]

Фармацевтические исследования

CRS также может изучать функции лекарств. Например, противолейкозный препарат. иматиниб изучаются с помощью SRS в клеточных линиях лейкемии.^[38] Исследование выявило возможный механизм его метаболизма в клетках и дало представление о способах повышения эффективности препарата.

Рамановские теги

Несмотря на то, что CRS позволяет создавать изображения без меток, рамановские теги также могут использоваться для усиления сигнала для определенных целей.^[42][9][8] Например, дейтерированные молекулы используются для сдвига рамановского сигнала в полосу, в которой отсутствуют помехи от других молекул. Специально разработанные молекулы, содержащие изотопы, могут быть использованы в качестве рамановских тегов для получения супермультиплексирующего многоцветного изображения с SRS.^[10]

Сравнение с конфокальной рамановской микроскопией

Конфокальный Рамановская микроскопия обычно используются лазеры непрерывного действия для получения спектра спонтанного комбинационного рассеяния в широком диапазоне волновых чисел для каждой точки изображения. Сканирование всего образца занимает много времени, поскольку для сбора данных каждому пикселю требуются секунды. Весь процесс визуализации длится долго, поэтому он больше подходит для неподвижных образцов. CRS, с другой стороны, измеряет сигналы с одним волновым числом, но позволяет быстрое сканирование. Если требуется больше спектральной информации, можно использовать многоцветный или гиперспектральный CRS, что соответственно ухудшит скорость сканирования или качество данных.^[43]

Сравнение SRS и CARS

В микроскопии CRS мы можем рассматривать SRS и CARS как два аспекта одного и того же процесса. Сигнал CARS всегда смешивается с нерезонансным четырехволновым смешанным фоном и имеет квадратичную зависимость от концентрации отображаемых химических веществ. SRS имеет гораздо меньший фон и линейно зависит от концентрации отображаемого химического вещества. Следовательно, SRS больше подходит для количественной визуализации, чем CARS. На стороне прибора SRS требует модуляции и демодуляции (например, синхронный усилитель или резонансный детектор). Для многоканальной визуализации SRS требует многоканальной демодуляции, в то время как CARS требуется только массив PMT или CCD. Следовательно, необходимые приборы для SRS сложнее, чем для CARS.^[16]

Что касается чувствительности, SRS и CARS обычно обеспечивают одинаковую чувствительность.^[44] Их различия в основном связаны с методами обнаружения. В CARS-микроскопии PMT, APD или CCD используются в качестве детекторов для обнаружения фотонов, генерируемых в процессе CARS. Чаще всего используются ФЭУ из-за их большой зоны обнаружения и высокой скорости. В SRS микроскопии фотодиоды обычно используются для измерения интенсивности лазерного луча. Из-за таких различий приложения CARS и SRS также различаются.^[16]

PMT обычно имеют относительно низкую квантовая эффективность по сравнению с фотодиодами. Это отрицательно повлияет на ОСШ микроскопии CARS. ФЭУ также имеют пониженную чувствительность для лазеров с длиной волны более 650 нм. Следовательно, с обычно используемой лазерной системой для CRS (Ti-сапфировый лазер ), CARS в основном используется для изображения в области высоких волновых чисел (2800–3400 см⁻¹). SNR микроскопии CARS обычно плохое для изображений отпечатков пальцев (400–1800 см⁻¹).^[16]

SRS микроскопия в основном использует кремниевый фотодиод как детекторы. Si-фотодиоды имеют гораздо более высокую квантовую эффективность, чем ФЭУ, что является одной из причин того, что SNR SRS во многих случаях может быть лучше, чем CARS. Si-фотодиоды также страдают пониженной чувствительностью, когда длина волны лазера превышает 850 нм. Однако чувствительность по-прежнему относительно высока и позволяет получать изображения в области отпечатков пальцев (400–1800 см⁻¹).^[16]

Смотрите также

Рекомендации