Тег, активирующий флуоресценцию и изменяющий поглощение - Википедия - Fluorescence-activating and absorption-shifting tag

БЫСТРЫЙ (Бирка, активирующая флуоресценцию и изменяющая поглощение) - небольшой, генетически закодированный, белковая метка что позволяет получать отчеты о флуоресценции интересующих белков. В отличие от природных флуоресцентных белков и производных, таких как GFP или mCherry, FAST сам по себе не флуоресцентный. Он может избирательно связывать флуорогенный хромофор, полученный из 4-гидроксибензилиден роданина (HBR), который сам по себе не является флуоресцентным, если не связан. После связывания пара молекул проходит через уникальный механизм активации флуорогена, основанный на двух спектроскопических изменениях, увеличении квантового выхода флуоресценции и красном смещении поглощения, что обеспечивает высокую селективность мечения. Система отчетов FAST-fluorogen может использоваться во флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и в любом другом флуорометрическом методе исследования живого мира: биосенсоров, торговли белками.

FAST, небольшой белок 14 кДа, был создан из фотоактивного желтого белка (PYP) путем направленной эволюции. Об этом впервые сообщили в 2016 году исследователи из Ecole normale supérieure de Paris.[1]

Механизм

FAST относится к химико-генетической стратегии специфической маркировки белков. Пептидный домен, называемый «меткой», генетически кодируется для связывания с представляющим интерес белком (путем комбинации их соответствующих генов посредством трансфекции или инфицирования). Этот тег является якорем для добавления синтетического флуоресцентного зонда.[2] Такой химико-генетический подход уже реализован помимо природных флуоресцентных белков, таких как GFP или их производные, такие как мЧерри в нескольких системах уже широко используются:

  • с 2003 г. SNAP-тег, двухкомпонентная система отчетности, состоящая из пептида 19 кДа, полученного из человеческого фермента, О6-метилгуанин-АДН-метилтрансфераза, образовавшая ковалентные связи с флуоресцентными О6производные бензилгуанина; Позже SNAP-тег превратился в ортогональный тег, CLIP-тег;
  • с 2008 года, HaloTag, двухкомпонентная система отчетности, состоящая из пептида 33 кДа, полученного из бактериального фермента, галогеналкандешалогеназы, который может специфически связывать функциональные галогенированные синтетические лиганды, чаще всего флуоресцентные для визуализации клеток (например, Кумарин, Oregon Green, Alexa Fluor 488, diAcFAM, TMR).
Обратимое связывание между FAST и флуорогеном

Было описано несколько версий FAST, отличающихся небольшим количеством мутаций, например, FAST1 (он же Y-FAST), FAST2 (он же iFAST) или димер, td-FAST.[3] Также была разработана версия с расщеплением комплементации для мониторинга белок-белковых взаимодействий, splitFAST.[4] Ряд плазмид, отображающих гены FAST или splitFAST, доступен в Addgene.[5]

Приложения

Система отчетов FAST-fluorogen используется в флуоресцентная микроскопия, проточной цитометрии и любые другие флуорометрические методы исследования живого мира, включая биосенсоры и торговля белками. Сообщалось, что FAST используется для динамической визуализации биопленок из-за его уникальной способности флуоресценции в условиях низкого содержания кислорода.[6] По той же причине он позволяет получать изображения и анализировать анаэробные микроорганизмы, такие как Clostridium, используется для ферментации биомассы, например ABE ферментация.[7] Также сообщалось о FAST для микроскопия сверхвысокого разрешения живых клеток.[8]

The Twinkle Factory разработала ряд флуорогенов для FAST и его производных, различающихся по длине волны излучения, яркости и сродству с метками. Некоторые не проникают, т.е., они не могут проходить через клеточные мембраны, поэтому специально маркируют мембранные белки или внеклеточные белки, что позволяет: например, отслеживание движения от синтеза до выделения.[9]

Рекомендации

  1. ^ Пламон, Мари-Од; Бийон-Дени, Эммануэль; Маурин, Сильви; Гаурон, Кэрол; Pimenta, Frederico M .; Specht, Christian G .; Ши, Цзянь; Керар, Жером; Пан, Буян; Россиньоль, Жюльен; Монкок, Карин (28 декабря 2015 г.). «Малая метка, активирующая флуоресценцию и изменяющая абсорбцию для настраиваемой визуализации белков in vivo». Труды Национальной академии наук. 113 (3): 497–502. Дои:10.1073 / pnas.1513094113. ISSN  0027-8424. ЧВК  4725535. PMID  26711992.
  2. ^ Пламон, Мари-Од; Бийон-Дени, Эммануэль; Маурин, Сильви; Гаурон, Кэрол; Pimenta, Frederico M .; Specht, Christian G .; Ши, Цзянь; Керар, Жером; Пан, Буян; Россиньоль, Жюльен; Монкок, Карин (19 января 2016). «Малая метка, активирующая флуоресценцию и изменяющая абсорбцию для настраиваемой визуализации белков in vivo». Труды Национальной академии наук. 113 (3): 497–502. Bibcode:2016ПНАС..113..497П. Дои:10.1073 / pnas.1513094113. ISSN  0027-8424. ЧВК  4725535. PMID  26711992.
  3. ^ Тебо, Элисон Дж .; Pimenta, Frederico M .; Чжан, Ю; Готье, Арно (2018-10-02). «Улучшенные химико-генетические флуоресцентные маркеры для микроскопии живых клеток» (PDF). Биохимия. 57 (39): 5648–5653. Дои:10.1021 / acs.biochem.8b00649. ISSN  0006-2960. PMID  30204425.
  4. ^ Тебо, Элисон Дж .; Готье, Арно (14.08.2019). «Авторская поправка: расщепленный флуоресцентный репортер с быстрым и обратимым дополнением». Nature Communications. 10 (1): 3730. Bibcode:2019НатКо..10.3730Т. Дои:10.1038 / s41467-019-11689-6. ISSN  2041-1723. ЧВК  6694131. PMID  31413330.
  5. ^ "Addgene: плазмиды лаборатории Арно Готье". www.addgene.org. Получено 2019-11-25.
  6. ^ Монмейран, Амори; Томен, Филипп; Жонкьер, Гюго; Сюро, Франк; Ли, Ченге; Пламон, Мари-Од; Дуарш, Карин; Казелла, Жан-Франсуа; Готье, Арно; Генри, Нелли (2018-07-09). «Индуцибельный химико-генетический флуоресцентный маркер FAST превосходит классические флуоресцентные белки в количественной оценке динамики бактериальной биопленки». Научные отчеты. 8 (1): 10336. Bibcode:2018НатСР ... 810336М. Дои:10.1038 / s41598-018-28643-z. ISSN  2045-2322. ЧВК  6037777. PMID  29985417.
  7. ^ Чарубин, Камил; Беннетт, Р. Кайл; Быстро, Алан Дж .; Папутсакис, Элефтериос Т. (ноябрь 2018 г.). «Конструирование организмов Clostridium как фабрик микробных клеток: проблемы и возможности». Метаболическая инженерия. 50: 173–191. Дои:10.1016 / j.ymben.2018.07.012. ISSN  1096-7176. PMID  30055325.
  8. ^ Венкатачалапати, Мутукумаран; Белапуркар, Вивек; Хосе, Мини; Готье, Арно; Наир, Дипак (2019). «Визуализация живых клеток в сверхвысоком разрешении по радиальным колебаниям с использованием меток, связывающих флюорог». Наномасштаб. 11 (8): 3626–3632. Дои:10.1039 / c8nr07809b. ISSN  2040-3364. PMID  30734810.
  9. ^ Ли, Ченге; Мортон, Орелиен; Пламон, Мари-Од; Родригес, Ванесса; Оджар, Изабель; Волович, Мишель; Ле Со, Томас; Перес, Франк; Вриз, Софи; Жюльен, Людовик; Жолио, Ален (20.06.2018). «Флуорогенное зондирование миграции мембранного белка» (PDF). Биоконъюгат химия. 29 (6): 1823–1828. Дои:10.1021 / acs.bioconjchem.8b00180. ISSN  1043-1802. PMID  29791141.