Модели изогенных заболеваний человека - Isogenic human disease models

Модели изогенных заболеваний человека представляют собой семейство ячеек, выбранных или созданных для точного моделирования генетика конкретной группы пациентов, in vitro. Им предоставляют генетически подобранную «нормальную клетку», чтобы обеспечить изогенную систему для исследования биологии болезни и новых терапевтических агентов.^[1] Их можно использовать для моделирования любого заболевания на генетической основе. Рак является одним из таких заболеваний, для которого широко используются модели изогенных заболеваний человека.

Исторические модели

Модели изогенных заболеваний человека сравнивают с «пациентами в пробирке», поскольку они включают новейшие исследования генетических заболеваний человека и делают это без трудностей и ограничений, связанных с использованием нечеловеческих моделей.^[2]

Исторически клетки, полученные от животных, обычно мышей, использовались для моделирования путей, связанных с раком. Однако существуют очевидные ограничения, присущие использованию животных для моделирования генетически обусловленных заболеваний человека. Несмотря на большую долю генетической консервации между людьми и мышами, существуют значительные различия между биологией мышей и людей, которые важны для исследований рака. Например, основные различия в теломер регулирование позволяет мышиным клеткам обходить требование теломераза повышающая регуляция, которая является лимитирующей стадией образования рака у человека. В качестве другого примера, определенные взаимодействия лиганд-рецептор несовместимы между мышами и людьми. Кроме того, эксперименты продемонстрировали важные и значительные различия в способности трансформировать клетки по сравнению с клетками мышиного происхождения. По этим причинам остается важным разработка моделей рака, в которых используются человеческие клетки.^[3]

Векторы нацеливания

Изогенные клеточные линии создаются с помощью процесса, называемого нацеливанием на гомологичный ген. Направляющие векторы, использующие гомологичную рекомбинацию, представляют собой инструменты или методы, которые используются для включения или выключения желаемой вызывающей заболевание мутации или SNP (однонуклеотидный полиморфизм ) для изучения. Хотя болезненные мутации могут быть получены непосредственно от больных раком, эти клетки обычно содержат множество фоновых мутаций в дополнение к конкретной представляющей интерес мутации, и подобранная нормальная клеточная линия обычно не получается. Впоследствии нацеленные векторы используются для 'подбивание ' или же 'нокаутировать мутации генов, позволяющие переключаться в обоих направлениях; от нормального генотипа к раковому; или наоборот; в охарактеризованных линиях раковых клеток человека, таких как HCT116 или Nalm6.^[4]

Существует несколько технологий нацеливания на гены, используемых для создания желаемой мутации, наиболее распространенные из которых кратко описаны, включая ключевые преимущества и ограничения, в сводной таблице ниже.

Техника	Gene Knock-In	Нокаут гена
rAAV (рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы)^[5]	Целевые вставки или модификации создаются внутри эндогенных генов; и поэтому подлежат: Правильные механизмы генной регуляции; и Точно отразите события болезни, обнаруженные у реальных пациентов. rAAV может вводить тонкие точечные мутации, SNP, а также небольшие вставки с высокой эффективностью. Более того, многие рецензируемые исследования показали, что rAAV не вносит никаких искажающих факторов в целевые геномные события.^{[нужна цитата ]} Похоже, что это предпочтительный метод, применяемый в академических кругах, биотехнологиях и фармацевтике с точки зрения точности, времени и стоимости.^{[нужна цитата ]}\|	Нокауты генов находятся в эндогенном локусе и, следовательно, являются окончательными, стабильными и релевантными для пациента. В других геномных локусах не возникает никаких смешанных нецелевых эффектов. Это требует двухэтапного процесса: Сгенерировать гетерозиготный нокаут Создайте биаллельный нокаут, нацеливаясь на второй аллель. Таким образом, этот процесс может генерировать 3 генотипа (+ / +; - / + и - / -); что делает возможным анализ гапло-недостаточной функции гена. Текущее ограничение - это необходимость последовательно нацеливать одиночные аллели, что делает создание нокаутных клеточных линий двухэтапным процессом.
Гомологичная рекомбинация на основе плазмид	Вставка происходит в эндогенном локусе и имеет все перечисленные выше преимущества, но очень неэффективна. Это также требует стратегии выбора лекарства без промотора, влекущей за собой создание конструкции на заказ. С помощью этого метода был создан большой исторический банк клеточных линий, который с середины 1990-х годов был вытеснен другими методами.	Делеция происходит в эндогенном локусе и имеет все перечисленные выше преимущества, но неэффективна. Это также требует стратегии выбора лекарственного средства без промотора, которая влечет за собой создание индивидуальной конструкции.
Флип-в	Это эффективный метод, позволяющий направленно вставлять «эктопические» трансгены в один заранее определенный локус генома (интеграция через Рекомбиназа FLP сайт). Это не метод модификации эндогенного локуса. Трансгены обычно находятся под контролем экзогенного промотора или частично определенной промоторной единицы в неправильном геномном местоположении. Следовательно, их экспрессия не будет находиться под той же геномной и эпигенетической регуляцией, как эндогенные локусы, что ограничивает полезность этих систем для изучения функций генов. Однако они хороши для получения быстрой и стабильной экспрессии экзогенных генов.	Непригодный
Цинк-пальцевые нуклеазы (ZFN)	Сообщалось, что ZFN достигают высоких показателей генетического нокаута в целевом эндогенном гене. Если ZFN доставляются совместно с трансгенной конструкцией, гомологичной целевому гену, также могут быть достигнуты генетические нокауты или вставки.^[6] Одним из потенциальных недостатков является то, что любые двойные разрывы нецелевых генов могут привести к случайным вставкам, делециям нецелевых генов и более широкой геномной нестабильности; искажая результирующий генотип.^[7] Однако не наблюдалось заметного увеличения скорости случайной интеграции плазмид в человеческих клетках, эффективно редактируемых с помощью ZFN, нацеленных на составной сайт узнавания длиной 24 п.н. ^[6]	ZFN - это эндонуклеазы, направленные на последовательность, которые обеспечивают быстрое и высокоэффективное (до 90% в основной популяции клеток) разрушение обоих аллелей целевого гена, хотя об изменениях потери функции, определяемых пользователем или пациентом, не сообщалось в настоящее время. похожие частоты. Нецелевые делеции или вставки в другом месте генома вызывают серьезную озабоченность. Преимущество скорости получения двуаллельного КО за одну стадию также частично смягчается, если все еще необходимо получить клональную клеточную линию для изучения функции генов в гомогенной клеточной популяции.
Мегануклеазы	Мегануклеазы функционально аналогичны ZFN. Существуют ограничения, присущие их использованию, такие как разработка вектора мегануклеазы, который может занять до 9 месяцев и стоить десятки тысяч долларов.^{[нужна цитата ]} Это делает мегануклеазы более привлекательными для таких важных приложений, как генная терапия, агробиотехнология и разработка линий биопродуктов.

Гомологичная рекомбинация в моделях раковых клеток

Гомологичная рекомбинация (HR) - это разновидность генетической рекомбинации, при которой генетические последовательности обмениваются между двумя подобными сегментами ДНК. HR играет важную роль в делении эукариотических клеток, способствуя генетическому разнообразию посредством обмена между соответствующими сегментами ДНК для создания новых и потенциально полезных комбинаций генов.

HR выполняет вторую жизненно важную роль в репарации ДНК, позволяя восстанавливать двухцепочечные разрывы в ДНК, что является обычным явлением в течение жизненного цикла клетки. Именно этот процесс искусственно запускается вышеперечисленными технологиями и запускается для того, чтобы вызвать «нокауты» или «нокауты» в определенных генах5,7.

Недавний ключевой прогресс был обнаружен с использованием AAV-гомологичных рекомбинационных векторов, которые увеличивают низкие естественные уровни HR в дифференцированных клетках человека в сочетании с последовательностями векторов, нацеленных на ген.

Схема типичного вектора rAAV (источник: https://www.horizondiscovery.com/gene-editing/raav )

Коммерциализация

Факторы, приведшие к недавней коммерциализации моделей изогенных раковых клеток человека для фармацевтической промышленности и исследовательских лабораторий, двояки.

Во-первых, успешное патентование технологии усовершенствованных векторов нацеливания обеспечило основу для коммерциализации моделей клеток, которые являются результатом применения этих технологий.

Во-вторых, тенденция относительно низких показателей успеха в фармацевтике RnD и огромные затраты создали реальную потребность в новых исследовательских инструментах, которые запрещают, как подгруппы пациентов будут реагировать положительно или быть устойчивыми к целевым лекарствам от рака на основе их индивидуального генетического профиля.

Несколько компаний работают над решением этой проблемы, список ключевых игроков и их технологические предложения представлены ниже.

Смотрите также

Новости

Мастерс-младший (декабрь 2000 г.). «Линии раковых клеток человека: факты и фантазии». Nat. Преподобный Мол. Cell Biol. 1 (3): 233–6. Дои:10.1038/35043102. PMID 11252900.
http://web.mit.edu/piyush/www/diseasemodels.pdf
http://www.genengnews.com/gen-news-highlights/gsk-to-use-horizon-discovery-s-cell-lines-for-cancer-related-metabolomics-research/78565157/
http://www.genomeweb.com/biotechtransferweek/horizon-discoverys-umb-cell-line-deal-latest-example-its-academic-collaboration-
http://www.genomeweb.com/dxpgx/tgen-horizon-discovery-set-pgx-pact
https://web.archive.org/web/20120420044126/http://www.tgen.org/news/index.cfm?pageid=57&newsid=1764 TD2
http://www.businessweekly.co.uk/life-sciences-archive/horizon-hooks-up-with-genentech.html^{[постоянная мертвая ссылка ]}
https://web.archive.org/web/20110712220150/http://www.horizondiscovery.com/uploads/horizon-downloads/horizon-xman-genesis-faqs.pdf /
http://www.cellectis.com/genome-engineering/meganucleases/engineered-meganucleases/meganuclease-technologies/^{[постоянная мертвая ссылка ]}
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/zinc-finger-nuclease-technology/custom-zfn.html
https://web.archive.org/web/20101215173538/http://tools.invitrogen.com/content.cfm?pageid=3375

Источники

Барделли А., Парсонс Д. В., Силлиман Н. и др. (Май 2003 г.). «Мутационный анализ кинома тирозина при колоректальном раке». Наука. 300 (5621): 949. Дои:10.1126 / science.1082596. PMID 12738854.
Коли М., Раго С., Ленгауэр С., Кинзлер К.В., Фогельштейн Б. (2004). «Простые способы создания нокаутов генов соматических клеток человека с использованием рекомбинантных аденоассоциированных вирусов». Нуклеиновые кислоты Res. 32 (1): 3e – 3. Дои:10.1093 / nar / gnh009. ЧВК 373311. PMID 14704360.
Ван З., Шен Д., Парсонс Д. В. и др. (Май 2004 г.). «Мутационный анализ тирозинфосфатома при колоректальном раке». Наука. 304 (5674): 1164–6. Дои:10.1126 / science.1096096. PMID 15155950.
Топалоглу О., Херли П.Дж., Йилдирим О., Сивин С.И., Бунц Ф. (2005). «Усовершенствованные методы создания нокаутных и нокаутных клеточных линий человека». Нуклеиновые кислоты Res. 33 (18): e158. Дои:10.1093 / нар / gni160. ЧВК 1255732. PMID 16214806.
Морони М., Сарторе-Бьянки А., Бенвенути С., Артале С., Барделли А., Сиена С. (ноябрь 2005 г.). «Соматическая мутация каталитического домена EGFR и лечение гефитинибом при колоректальном раке». Анна. Онкол. 16 (11): 1848–9. Дои:10.1093 / annonc / mdi356. PMID 16012179.
Ди Николантонио Ф, Барделли А (январь 2006 г.). «Мутации киназ при раке: щели в броне врага?». Curr Opin Oncol. 18 (1): 69–76. Дои:10.1097 / 01.cco.0000198020.91724.48. PMID 16357567.
Бенвенути С., Сарторе-Бьянки А., Ди Николантонио Ф. и др. (Март 2007 г.). «Онкогенная активация сигнального пути RAS / RAF ухудшает ответ метастатического колоректального рака на терапию антителами против рецептора эпидермального фактора роста». Рак Res. 67 (6): 2643–8. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-06-4158. PMID 17363584.
Arena S, Pisacane A, Mazzone M, Comoglio PM, Bardelli A (июль 2007 г.). «Генетическое нацеливание киназной активности рецептора Met в раковых клетках». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 104 (27): 11412–7. Дои:10.1073 / pnas.0703205104. ЧВК 2040912. PMID 17595299.
Кониши Х., Каракас Б., Абухдейр А.М. и др. (Сентябрь 2007 г.). «Включение мутантных K-ras в неопухолевые эпителиальные клетки человека как новая модель для изучения K-ras-опосредованной трансформации». Рак Res. 67 (18): 8460–7. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-07-0108. PMID 17875684.
Arena S, Isella C, Martini M, de Marco A, Medico E, Bardelli A (сентябрь 2007 г.). «Включение онкогенного Краса не трансформирует соматические клетки мышей, но запускает транскрипционный ответ, который классифицирует рак человека». Рак Res. 67 (18): 8468–76. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-07-1126. PMID 17875685.
Грим Дж. Э., Густафсон М. П., Хирата Р. К. и др. (Июнь 2008 г.). «Зависимая от изоформы и клеточного цикла деградация субстрата убиквитинлигазой Fbw7». J. Cell Biol. 181 (6): 913–20. Дои:10.1083 / jcb.200802076. ЧВК 2426948. PMID 18559665.
Фаттах Ф. Дж., Лихтер Н. Ф., Фаттах К. Р., О С., Хендриксон Е. А. (июнь 2008 г.). «Ku70, важный ген, модулирует частоту нацеливания rAAV-опосредованного гена в соматических клетках человека». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 105 (25): 8703–8. Дои:10.1073 / pnas.0712060105. ЧВК 2438404. PMID 18562296.
Ди Николантонио Ф., Мартини М., Молинари Ф. и др. (Декабрь 2008 г.). «BRAF дикого типа необходим для ответа на панитумумаб или цетуксимаб при метастатическом колоректальном раке». J. Clin. Онкол. 26 (35): 5705–12. Дои:10.1200 / JCO.2008.18.0786. HDL:2434/349662. PMID 19001320. Архивировано из оригинал на 2013-04-15.
Ди Николантонио Ф., Арена С, Галликкио М. и др. (Декабрь 2008 г.). «Замена нормальных аллелей мутантными в геноме нормальных клеток человека раскрывает специфичные для мутаций реакции на лекарства». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 105 (52): 20864–9. Дои:10.1073 / pnas.0808757105. ЧВК 2634925. PMID 19106301.
Густин Дж. П., Каракас Б., Вайс МБ и др. (Февраль 2009 г.). «Нокин мутанта PIK3CA активирует множественные онкогенные пути». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 106 (8): 2835–40. Дои:10.1073 / pnas.0813351106. ЧВК 2636736. PMID 19196980.
Сарторе-Бьянки А., Мартини М., Молинари Ф. и др. (Март 2009 г.). «Мутации PIK3CA при колоректальном раке связаны с клинической устойчивостью к моноклональным антителам, нацеленным на EGFR». Рак Res. 69 (5): 1851–7. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-08-2466. PMID 19223544.
Sur S, Pagliarini R, Bunz F и др. (Март 2009 г.). «Панель изогенных раковых клеток человека предлагает терапевтический подход к лечению рака с помощью инактивированного p53». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 106 (10): 3964–9. Дои:10.1073 / pnas.0813333106. ЧВК 2656188. PMID 19225112.
Юн Дж., Раго С., Чеонг И. и др. (Сентябрь 2009 г.). «Депривация глюкозы способствует развитию мутаций пути KRAS в опухолевых клетках». Наука. 325 (5947): 1555–9. Дои:10.1126 / science.1174229. ЧВК 2820374. PMID 19661383.
Сарторе-Бьянки А., Ди Николантонио Ф., Ничелатти М. и др. (2009). Кордес Н. (ред.). «Мульти-детерминантный анализ молекулярных изменений для прогнозирования клинической пользы моноклональных антител, нацеленных на EGFR, при колоректальном раке». PLoS ONE. 4 (10): e7287. Дои:10.1371 / journal.pone.0007287. ЧВК 2750753. PMID 19806185.
Эндогенная экспрессия онкогенной мутации PI3K приводит к активации передачи сигналов PI3K и инвазивному фенотипу Плакат представлен на AACR / EORTC Molecular Targets and Cancer Therapeutics, Бостон, США, ноябрь 2009 г.
Барделли А., Сиена С. (март 2010 г.). «Молекулярные механизмы устойчивости к цетуксимабу и панитумумабу при колоректальном раке». J. Clin. Онкол. 28 (7): 1254–61. Дои:10.1200 / JCO.2009.24.6116. PMID 20100961. Архивировано из оригинал на 2013-04-15.
Фаттах Ф., Ли Э. Х., Вайзенсель Н., Ван Й., Лихтер Н., Хендриксон Э. А. (февраль 2010 г.). Пирсон CE (ред.). «Ku регулирует выбор негомологичного пути соединения концов при репарации двухцепочечных разрывов ДНК в соматических клетках человека». PLoS Genet. 6 (2): e1000855. Дои:10.1371 / journal.pgen.1000855. ЧВК 2829059. PMID 20195511.
Бурон Н., Порседду М., Брабант М. и др. (2010). Азиз С.А. (ред.). «Использование митохондрий линий раковых клеток человека для изучения механизмов пептидов BH3 и ABT-737-индуцированной проницаемости митохондриальной мембраны». PLoS ONE. 5 (3): e9924. Дои:10.1371 / journal.pone.0009924. ЧВК 2847598. PMID 20360986.
Эндогенная экспрессия онкогенной мутации PI3K приводит к накоплению антиапоптотических белков в митохондриях Плакат представлен на AACR 2010, Вашингтон, округ Колумбия, США, апрель. 2010 г.
Использование изогенных клеточных линий X-MAN для определения профилей активности ингибитора PI3-киназы Плакат представлен на AACR 2010, Вашингтон, округ Колумбия, США, апрель. 2010 г.
Использование мутанта PI3CA «X-MAN» увеличивает экспрессию отдельных изоформ тубулина и способствует устойчивости к антимитотическим химиотерапевтическим препаратам. Плакат представлен на AACR 2010, Вашингтон, округ Колумбия, США, апрель. 2010 г.
Ди Николантонио Ф., Арена С, Табернеро Дж. И др. (Август 2010 г.). «Дерегуляция сигнальных путей PI3K и KRAS в раковых клетках человека определяет их ответ на эверолимус». J. Clin. Вкладывать деньги. 120 (8): 2858–66. Дои:10.1172 / JCI37539. ЧВК 2912177. PMID 20664172.

[1] Торранс К.Дж., Агравал В., Фогельштейн Б., Кинцлер К.В. (октябрь 2001 г.). «Использование изогенных раковых клеток человека для высокопроизводительного скрининга и открытия лекарств». Nat. Биотехнология. 19 (10): 940–5. Дои:10.1038 / nbt1001-940. PMID 11581659.

[2] Гупта, Пиюш Б .; Купервассер, Шарлотта (2004). «Болезнь модели рака груди». Открытие наркотиков сегодня. 1: 9–16. Дои:10.1016 / j.ddmod.2004.05.001.

[3] Хирата Р., Чемберлен Дж., Донг Р., Рассел Д. В. (июль 2002 г.). «Направленная вставка трансгена в хромосомы человека аденоассоциированными вирусными векторами». Nat. Биотехнология. 20 (7): 735–8. Дои:10.1038 / nbt0702-735. PMID 12089561.

[4] Мастерс-младший (декабрь 2000 г.). «Линии раковых клеток человека: факты и фантазии». Nat. Преподобный Мол. Cell Biol. 1 (3): 233–6. Дои:10.1038/35043102. PMID 11252900.

[5] Энгельгардт Дж. Ф. (август 2006 г.). "AAV попадает в яблочко генома". Nat. Биотехнология. 24 (8): 949–50. Дои:10.1038 / nbt0806-949. PMID 16900138.

[Urnov2010-6] а ^б Урнов, Федор Д .; Rebar, Эдвард Дж .; Холмс, Майкл С .; Чжан, Х. Стив; Грегори, Филип Д. (2010). «Редактирование генома с помощью сконструированных нуклеаз цинковых пальцев». Природа Обзоры Генетика. 11 (9): 636–646. Дои:10.1038 / nrg2842. PMID 20717154.

[7] Радеке С., Радеке Ф., Катомен Т., Шварц К. (апрель 2010 г.). «Индуцированная нуклеазой цинкового пальца репарация генов с помощью олигодезоксинуклеотидов: желаемые и нежелательные модификации целевого локуса». Мол. Ther. 18 (4): 743–53. Дои:10.1038 / мт.2009.304. ЧВК 2862519. PMID 20068556.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]