Фенол-хлороформная экстракция - Phenol–chloroform extraction

Фенол-хлороформная экстракция это жидкость-жидкостная экстракция техника в молекулярная биология используется для разделения нуклеиновые кислоты из белки и липиды.[1]

Процесс

Водные образцы, лизированные клетки или гомогенизированная ткань смешиваются с равными объемами фенол:хлороформ смесь. Затем эту смесь центрифугируют. Поскольку фенол:хлороформ смесь не смешивается с водой, центрифуга вызовет образование двух различных фаз: верхней водной фазы и нижней органической фазы. Водная фаза поднимается вверх, потому что она менее плотная, чем органическая фаза, содержащая фенол: хлороформ. Эта разница в плотности является причиной того, что фенол, который имеет лишь немного более высокую плотность, чем вода, должен быть смешан с хлороформом для образования смеси с гораздо более высокой плотностью, чем вода.

Гидрофобные липиды разделятся на нижнюю органическую фазу, а белки останутся на границе раздела между двумя фазами, в то время как нуклеиновые кислоты (а также другие загрязнители, такие как соли, сахара и т.д.) останутся в верхней водной фазе. Затем можно отобрать верхнюю водную фазу. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не допустить пипетирование какой-либо органической фазы или материала на интерфейс. Эта процедура часто выполняется несколько раз, чтобы повысить чистоту ДНК.[2] Эта процедура дает большую двухцепочечную ДНК, которую можно использовать в ПЦР или же RFLP.

Если смесь кислая, ДНК выпадет в органическую фазу, пока РНК остается в водной фазе. Это потому, что ДНК легче нейтрализуется, чем РНК.

У этого метода есть некоторые недостатки в судебной медицине. Это требует много времени и использует опасные реагенты. Кроме того, поскольку это двухэтапный процесс, связанный с переносом реагентов между пробирками, он подвергается большему риску загрязнение.[3]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Chan, P K S .; Chan, D. P .; К, К. Ф .; Yu, M. Y .; Cheung, J. L .; Ченг, А. Ф. (2001). «Оценка методов экстракции из тканей, залитых парафином, для ПЦР-амплификации человеческой и вирусной ДНК». Журнал клинической патологии. 54 (5): 401–403. Дои:10.1136 / jcp.54.5.401. ЧВК  1731425. PMID  11328843.
  2. ^ Самбрук, Джозеф; Рассел, Дэвид В. (2001). «Обычно используемые методы молекулярного клонирования». Молекулярное клонирование. 3.
  3. ^ Ли, Ричард (2015). Судебная биология. Бока-Ратон: CRC Press, Taylor & Francis Group. С. 115–117. ISBN  9781439889701.